論口腔臨床中牙周膜的再生治療

【中圖分類(lèi)號(hào)】R722.12【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）10-0241-02

近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)，牙周膜細(xì)胞具有異質(zhì)性，包含異質(zhì)性細(xì)胞群，即由不同的亞型組成，細(xì)胞間存在差異，在表現(xiàn)型及功能上有所不同，其子代能增殖產(chǎn)生成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞亞型可處于不同的分化階段或具有不定向的分化趨勢(shì)，牙周組織再生修復(fù)與牙周膜細(xì)胞的異質(zhì)性有密切關(guān)系。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器。DMEM培養(yǎng)液、FBS（Gibco公司，美國(guó)），胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、L-抗壞血酸、beta；-甘油磷酸鈉（beta；-glycerophyosphate，beta；-GP）、消炎痛、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-xan-thine，IBMX）、胰島素、beta；-巰基乙醇（beta；-mercap-toethanol，beta；-ME）（Sigma公司，美國(guó)），鼠抗人STRO-1多抗、鼠抗人CD146多抗（RDSystems公司，美國(guó)），CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱（Heraeus公司，德國(guó)），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），低溫高速離心機(jī)（Heraeus公司，德國(guó)），倒置顯微鏡及照像系統(tǒng)（Olympus公司，日本）。

1.2組織塊法細(xì)胞原代培養(yǎng)。收集臨床上12～18歲因正畸需要拔除的牙周健康、無(wú)齲的新鮮前磨牙，拔除后立即在雙抗PBS液和DMEM液中反復(fù)清洗牙齒，刮下根中1/3牙周膜組織，剪成0.5mmtimes；0.5mmtimes；0.5mm左右的小塊。

1.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色hPDLP的表面抗體。取生長(zhǎng)良好的第1代細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，用SABC法染色進(jìn)行波形絲蛋白Vimentin、角蛋白Keratin、STRO-1、CD146免疫組化染色，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟不變，進(jìn)行細(xì)胞來(lái)源及表達(dá)檢測(cè)，光鏡觀察。

1.4流式細(xì)胞表型分析hPDLP的表面標(biāo)記。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第1～3代細(xì)胞，0.25%胰酶消化1min，1000rmiddot；min-1離心5min，棄上清液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1times；106個(gè)，PBS洗2遍，加0.02mL的FCM緩沖液（含20gmiddot；L-1牛血清白蛋白和0.1gmiddot；L-1疊氮化鈉）重懸，PE標(biāo)記的STRO-1和FITC標(biāo)記的CD146抗體避光4℃孵育20min，加0.2mLPBS重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞生長(zhǎng)情況。組織塊法原代培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞3～6d后，可見(jiàn)多個(gè)組織塊邊緣有細(xì)胞開(kāi)始游出，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別，大多數(shù)為長(zhǎng)梭形成纖維狀，1～2個(gè)突起；少數(shù)為多角形、紡錘狀或橢圓形，體積較小，胞體豐滿，生長(zhǎng)較快，約7～14d開(kāi)始匯合，以組織塊為中心呈放射狀、螺旋狀生長(zhǎng)原代hPDLP培養(yǎng)10d的生長(zhǎng)狀態(tài)倒置相差顯微鏡times；40。生長(zhǎng)的細(xì)胞以1∶2傳代培養(yǎng)，最初5代的細(xì)胞培養(yǎng)3～5d即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶瓶底，生長(zhǎng)狀態(tài)較活躍，核分裂象多見(jiàn)；6～12代細(xì)胞，培養(yǎng)7～10d鋪滿，細(xì)胞增殖穩(wěn)定。

2.2細(xì)胞表型鑒定。免疫組化顯示細(xì)胞波形絲蛋白染色陽(yáng)性第1代hPDLP抗波形絲蛋白的陽(yáng)性染色SABCtimes；400，角蛋白染色陰性。第1代牙周膜細(xì)胞中部分細(xì)胞抗STRO-1和CD146染色著色，細(xì)胞表達(dá)STRO-1和CD146強(qiáng)弱不等第1代hPDLP抗CD146染色的陽(yáng)性染色SABCtimes；400第1代hPDLP抗STRO-1的陽(yáng)性染色SABCtimes；400。

2.3流式細(xì)胞表型分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第1～3代的hPDLP，STRO-1陽(yáng)性率分別為4.23%plusmn；4.08%、1.92%plusmn；1.77%和0.44%plusmn；0.24%，LSD法比較兩兩之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；CD146陽(yáng)性率分別為27.20%plusmn；3.98%、18.83%plusmn；4.04%和10.61%plusmn；4.61%，LSD法比較兩兩之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4成骨誘導(dǎo)結(jié)果。礦化液連續(xù)培養(yǎng)10d左右第1代細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)，明顯增厚，為局灶狀，中央出現(xiàn)許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高。15d左右孔板底部出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的針尖大小灰白色小結(jié)節(jié)，并逐漸增大，21d后行vonKossa和茜素紅染色可見(jiàn)大量染成棕褐色的片狀礦化結(jié)節(jié)，周邊界限不清hPDLP礦化誘導(dǎo)21d后礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色times；200。

2.5成脂誘導(dǎo)結(jié)果。第1代hPDLP經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)部分胞質(zhì)內(nèi)有大小不一的脂肪滴形成，經(jīng)油紅O染色脂滴染成紅色第1代hPDLP成脂誘導(dǎo)21d后脂滴形成油紅O染色times；400。第8代牙周膜細(xì)胞經(jīng)脂肪誘導(dǎo)，倒置顯微鏡下雖也可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有脂滴形成，但形成的量要明顯少于第1代細(xì)胞第8代hPDLP成脂誘導(dǎo)21d后脂滴形成油紅O染色times；400。

3討論

近年來(lái)，隨著成體干細(xì)胞研究的不斷深入，采用成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞運(yùn)用于口腔組織工程的研究逐漸展開(kāi)。牙周膜干細(xì)胞同其他組織的成體干細(xì)胞一樣，目前尚缺乏特異性的表面標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行鑒定和分離純化。Shi等[5]利用酶消化法通過(guò)有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化獲得PDLSC，采用直接組織塊法培養(yǎng)所得的細(xì)胞即為人牙周膜細(xì)胞群，首次對(duì)hPDLP和PDLSC的特性進(jìn)行了對(duì)比研究，PDLSC細(xì)胞形態(tài)呈圓形或不規(guī)則形狀，周邊部細(xì)胞呈梭形或多角形，體積較小，部分細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞狀，hPDLP主要為胞體較大的成纖維樣細(xì)胞和少量小而不規(guī)則形的細(xì)胞。hPDLP的概念逐漸明了，是含有干細(xì)胞成分的異質(zhì)性細(xì)胞群，但是對(duì)其多向分化潛能的研究在國(guó)內(nèi)外均少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究hPDLP多向誘導(dǎo)分化潛能，進(jìn)一步探索hPDLP在體外是否具有干細(xì)胞群的特征。

本研究就hPDLP的橫向分化能力從礦化和成脂方向進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，第1～3代的hPDLP中含有一定比例的干細(xì)胞，在體外具有干細(xì)胞群的誘導(dǎo)分化能力。hPDLP的體外成功培養(yǎng)鑒定，將為后期研究牙周膜牙骨質(zhì)復(fù)合體的人工生物器官的構(gòu)建和牙周膜再生治療提供重要的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]孫蕾，朱慧勇.間充質(zhì)干細(xì)胞非分化性增殖的研究進(jìn)展[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，36（2）：235-238.

[2]金巖.組織工程學(xué)原理與技術(shù)[M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2004：36-50.