厄貝沙坦對CTGF在糖尿病腎病大鼠腎臟中表達影響的研究

【摘要】目的：探討厄貝沙坦對CTGF在糖尿病腎病大鼠腎臟中表達影響的研究，對其干預(yù)后的腎皮質(zhì)中結(jié)締組織生長因子的表達情況進行進一步分析研究。方法：選取于2013年2月-2014年2月在我院進行研究的48只糖尿病腎病大鼠，將其隨機分為對照組（A組），糖尿病腎病組（B組）和治療組（C組），糖尿病腎病組和治療組的兩組糖尿病腎病大鼠分別對其進行臨床藥物注射治療和研究，治療組聯(lián)合使用厄貝沙坦進行治療，對照組給予相同量的檸檬酸緩沖液。分別對三組大鼠標本的的各項身體指標進行測定。結(jié)果：A組大鼠飼養(yǎng)12周后無1例死亡。B組大鼠2例造模未成功而放棄；另有3例于第1周內(nèi)死亡，死亡原因考慮與STZ毒性或發(fā)生酮癥酸中毒有關(guān)。C組大鼠有2例于第1周內(nèi)死亡，死因同上；另有1只于第7周死亡，原因不明。存活大鼠的活動及精神狀態(tài)均正常。同時三組大鼠標本的的各項身體指標兩兩對比，存在顯著性差異（P<0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：厄貝沙坦對CTGF在糖尿病腎病大鼠的臨床應(yīng)用效果非常顯著，在對其進行臨床藥物注射治療以后，鏈脲佐菌素發(fā)揮了重要作用，使得大鼠的膽固醇含量下降，尿蛋白、血肌酐等表達減少，因此這種治療方法值得在臨床上推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】厄貝沙坦；CTGF；糖尿病腎病；腎臟表達；影響研究

【Abstract】Objective：To explore urban bei sha temple of CTGF in diabetic nephropathy rats kidney research on the effects of expression， of its prognosis of connective tissue growth factor in renal cortex expression for further analysis. Methods： Selection in February 2013 - February 2014 in our hospital to study of 48 diabetic nephropathy rats， it were randomly divided into control group （group A） and diabetic nephropathy group （group B） and treatment group （group C）， diabetic nephropathy group and treatment group respectively of the two groups of diabetic nephropathy rats to clinical drug injection therapy and research， the treatment group treated with combination of he sand， the control group to give the same amount of citric acid buffer. Respectively for the physical indexes of three groups of big mouse of this. Results： A group of 12 weeks after rat feeding 1 had no effect. Group B in the rat made mold 2 cases failed and give up； Otherwise in 3 patients died within the first week， the death reasons related to STZ toxicity or ketoacidosis. In 2 cases of group C rats died within the first week， the cause of death as above； Another 1 died in 7 weeks， but for unknown reasons. Survival rats activities and mental state of all normal. At the same time， the physical indexes of three groups of big mouse of the two contrast， there is significant difference （P < 0.05）， with statistical significance.Conclusion： the treatment group rats after to clinical drug injection therapy， chain urea with bacteria play an important role， makes the rats of cholesterol levels dropped， reducing urinary protein， serum creatinine and expression， so the treatment method is worth popularizing in clinical application.

【key words 】he sha Tanzania； CTGF. Diabetic nephropathy； Kidney expression； Impact study

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）10-0003-01

隨著人民生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，人們的健康狀況也發(fā)生了明顯的差異，其健康狀況每況日下，糖尿病成為了其中一種發(fā)病率較高的疾病，其糖尿病腎病成為了糖尿病患者的一種并發(fā)癥狀。在歐洲國家的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者的發(fā)病率很高，已經(jīng)超過了35%，但是在我國的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者的發(fā)病率目前也發(fā)生了較大幅度的增長，已經(jīng)增長到了15%[1]。本文通過選取于2013年2月-2014年2月在我院進行研究的48只糖尿病腎病大鼠，分別對三組研究大鼠在四周、八周、十二周時選取四只大鼠，并且將選取的大鼠進行收集，作為標本進行回收研究，對大鼠標本的的各項身體狀況，包括血糖含量、血肌酐、膽固醇含量、甘油三酯含量以及大鼠一天的尿蛋白含量等進行指標測定，并且將其檢測的數(shù)據(jù)進行準確的記錄。對其檢測結(jié)果進行臨床對比，現(xiàn)資料統(tǒng)計如下。

資料與方法

1.1臨床資料

3月齡SPF級Wister大鼠（購于青島市藥檢所），48只大鼠中，其中23只母鼠，25只公鼠，年齡是2.8個月—3.5個月，大鼠健康狀況良好，按照隨機分組方法對其進行分組，三組大鼠一般臨床資料相比，無顯著差異性（P>0.05），具有可比性。厄貝沙坦（購于杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司），鏈脲佐菌素（STZ，購于美國Sigma 公司），Trizol提取液（購于美國Invetrigen公司），RT-PCR相關(guān)試劑盒（購于日本Takara公司），羊抗鼠CTGF多克隆抗體（購于美國SANTA CRUZ公司 sc-14939 ），辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG（購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司ZB2306），化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（購于香港吳柏生物科技有限公司）。

1.2 動物分組與標本收集測定

選取于2013年2月-2014年2月在我院進行研究的48只糖尿病腎病大鼠，將其隨機分為對照組（A組）14只，糖尿病腎病組（B組）17只和治療組（C組）17只，糖尿病腎病組和治療組的兩組糖尿病腎病大鼠分別對其進行臨床藥物注射治療和研究，給予其每千克有效成分含量為55毫克的鏈脲佐菌素進行臨床注射，治療組在聯(lián)合使用厄貝沙坦進行治療，對照組給予相同量的檸檬酸緩沖液對大鼠進行腹腔下臨床注射。A組與B組分別給予等體積生理鹽水，C組給予厄貝沙坦（50mg/ kg）每日一次灌胃。分別對三組研究大鼠在四周、八周、十二周時選取四只大鼠，并且將選取的大鼠進行收集，作為標本進行回收研究，對大鼠標本的的各項身體狀況，包括血糖含量、血肌酐、膽固醇含量、甘油三酯含量以及大鼠一天的尿蛋白含量等進行指標測定，收集腎組織標本，凍存于-70℃用于實驗，并且將其檢測的數(shù)據(jù)進行準確的記錄。用RT-PCR法檢測腎皮質(zhì)CTGFmRNA表達水平，對其檢測結(jié)果進行臨床對比。

1.3 RT-PCR分析

使用Trizol試劑提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行PCR反應(yīng)。CTGF擴增引物序列：上游：5’- AGCTGCCTACCGACTGGAAGA-3’ 下游：5’- CTTCTCCAGCCTGCAGAAGGT-3’ 產(chǎn)物長度160bp。內(nèi)參照GAPDH擴增引物序列：上游：5’-GCCATCAACGACCCCTTCATTG -3’，下游：5’-TGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3’，產(chǎn)物長度598bp。對A CTGF/AGAPDH的比值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 Western Blot分析

充分研磨裂解組織后，離心取上清液12ul與4ul蛋白上樣緩沖液混合水浴變性，經(jīng)12%SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜加入羊抗鼠CTGF抗體（一抗 1：800稀釋）4℃過夜，再加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG（二抗 1：8000稀釋）充分反應(yīng)。經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑處理過的PVDF膜在暗室中用X膠片曝光，并用凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司，JS-380B全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀）半定量分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

本次采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理分析，計量資料采用t檢驗，組間對比采用X2檢驗，P<0.05為差異顯著性，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠存活情況

A組大鼠飼養(yǎng)12周后無1例死亡。B組大鼠2例造模未成功而放棄；另有3例于第1周內(nèi)死亡，死亡原因考慮與STZ毒性或發(fā)生酮癥酸中毒有關(guān)。C組大鼠有2例于第1周內(nèi)死亡，死因同上；另有1只于第7周死亡，原因不明。存活大鼠的活動及精神狀態(tài)均正常。

2.2各組糖尿病腎病大鼠的體重、血糖的變化結(jié)果對比

糖尿病腎病組和對照組，治療組和對照組的大鼠的血糖含量、體重指標存在顯著性差異（P<0.05），明顯高于對照組大鼠的各類臨床指標數(shù)據(jù)，兩組結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4各組大鼠血膽固醇、甘油三酯的結(jié)果對比

治療組和糖尿病腎病組大鼠的膽固醇、甘油三酯含量隨著治療時間的延長，在第四周、第八周的時候明顯高于對照組大鼠的膽固醇、甘油三酯含量，治療組和對照組結(jié)果以及糖尿病腎病組和對照組結(jié)果對比都存在明顯差異（P<0.05），結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義。同時在第十二周的研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病組大鼠的膽固醇、甘油三酯含量仍然高于對照組，但是治療組大鼠的膽固醇、甘油三酯含量和對照組相比較沒有顯著性差異（P>0.05），不具有統(tǒng)計學(xué)意義。治療組大鼠的膽固醇含量隨著治療時間的延長，其呈現(xiàn)出了下降趨勢，并且在治療4周結(jié)束時的膽固醇含量和治療12周結(jié)束時的膽固醇含量存在明顯差異（P<0.05），兩組結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

糖尿病腎病的主要表現(xiàn)就是腎臟變大，腎小球出現(xiàn)較高灌注，同時腎小球細胞外的基質(zhì)出現(xiàn)了增生狀況，最終造成硬化，進一步病情惡化后形成了可怕的腎臟功能衰竭。結(jié)締組織生長因子是近年來發(fā)現(xiàn)的與促進纖維化，介導(dǎo)細胞黏附遷移，促進細胞外基質(zhì)（ECM）沉積有密切關(guān)系的細胞因子，并在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。已有研究證明，結(jié)締組織生長因子在糖尿病腎病中的表達明顯增高[2]。在此過程中CTGF高表達并作為TGF-β1的下游介質(zhì)，介導(dǎo)細胞外基質(zhì)形成，對DN腎纖維化起重要作用[3]。

CTGF是Bradham等[4]于1991年首次在人的臍靜脈內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的細胞因子，主要有以下生物學(xué)作用：促進細胞增殖轉(zhuǎn)化、使細胞外基質(zhì)（ECM）含量增高、介導(dǎo)細胞黏附遷移、促纖維化等作用。在病理狀態(tài)下，腎小球系膜細胞產(chǎn)生CTGF增多，導(dǎo)致細胞增生并促使系膜細胞和腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化為增生活躍的肌成纖維細胞，使細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積增加，引起纖維化損傷[5]。在糖尿病患者腎活檢時也發(fā)現(xiàn)，腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化的區(qū)域CTGFmRNA 的表達顯著增加，并與纖維化程度相關(guān)[6]-[7]。

腎小管上皮細胞存在血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）的受體AT1和ATⅡ，Ang Ⅱ正是通過其受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。AngⅡ能引起腎臟血液動力學(xué)改變，致腎小球高灌注，高壓力，高濾過從而損害腎臟。

厄貝沙坦是一種強力高選擇性口服血管緊張素II受體（AT1亞型）拮抗劑[8]，它能完全阻斷由AT1介導(dǎo)的血管緊張素II的全部活性，與血管緊張素II的來源或合成途徑無關(guān)。

本文通過選取我院三組不同研究方法的大鼠在四周、八周、十二周時的各項臨床指標，包括血糖含量、血肌酐、膽固醇含量、甘油三酯含量以及大鼠一天的尿蛋白含量等，對其檢測結(jié)果進行臨床對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病組和對照組，治療組和對照組的大鼠的血糖含量、體重指標存在顯著性差異（P<0.05），明顯高于對照組大鼠的各類臨床指標數(shù)據(jù)，兩組結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義。同時對照組大鼠在治療四周、八周和十二周的24小時尿蛋白定量檢測結(jié)果分別是0.62±0.35 mg/24h、5.09±0.87 mg/24h和3.47±0.49 mg/24h；糖尿病腎病組大鼠在治療四周、八周和十二周的24小時尿蛋白定量檢測結(jié)果分別是0.81±0.20 mg/24h、6.80±1.12 mg/24h和3.27±0.78mg/24h；治療組大鼠在治療四周、八周和十二周的24小時尿蛋白定量檢測結(jié)果分別是0.63±0.25mg/24h、7.07±2.08 mg/24h和1.95±1.15mg/24h。這說明治療組大鼠的尿蛋白定量、血肌酐等表達和治療前相比也發(fā)生了較大的變化，其表達明顯減少，治療組大鼠的尿蛋白定量、血肌酐等表達和糖尿病腎病組相比存在明顯差異（P<0.05），兩組結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明厄貝沙坦有可能通過阻斷由AT1介導(dǎo)的血管緊張素II的活性，從而阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)，進而抑制CTGF的過度或高表達。厄貝沙坦對CTGF在糖尿病腎病大鼠的臨床應(yīng)用效果非常顯著，在對其進行臨床藥物注射治療以后，鏈脲佐菌素發(fā)揮了重要作用，使得大鼠的膽固醇含量下降，尿蛋白、血肌酐等表達減少，因此這種治療方法值得在臨床上推廣應(yīng)用。

并且有實驗已經(jīng)證實AT1能在受體水平阻斷AngⅡ刺激GLUT-1轉(zhuǎn)錄及蛋白合成的作用，改善糖尿病腎病大鼠糖代謝[10]。由此我們推斷，厄貝沙坦可能通過以上機制實現(xiàn)延緩腎小球纖維化、細胞外基質(zhì)沉積等，改善糖尿病腎病病程中血糖、尿素氮、肌酐和24小時尿蛋白排泄量水平；厄貝沙坦還糾正了糖尿病腎病病程中的脂代謝紊亂（膽固醇和甘油三酯水平降低），但作用機制尚待進一步研究。

結(jié)合本實驗，我們認為厄貝沙坦能降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白排泄量，糾正糖脂代謝紊亂，延緩腎功能衰竭的進展。但其最佳的應(yīng)用劑量、療程、適應(yīng)癥及相應(yīng)的副作用仍需進一步的研究。已經(jīng)有許多研究證明，雖然TGFβ在腎臟纖維化中起到了舉足輕重的作用，但其靶效應(yīng)多，作用機制復(fù)雜，完全阻斷恐帶來難以預(yù)料的結(jié)果[11]，同樣作為TGFβ的下游效應(yīng)因子CTGF 若被完全阻斷是否也會帶來不良的后果，這就需要我們在以后的研究中不斷探索。

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