D-乳酸高產菌菊糖芽胞乳桿菌Y2-8磷酸果糖激酶基因在大腸桿菌中的克隆和表達

鄭 璐，柏中中，許婷婷，何冰芳

(1.南京工業大學 生物與制藥工程學院，南京 211800;2.南京中醫藥大學 基礎醫學院，南京 210046)

D-乳酸是一種重要的手性中間體，已被用于多種手性物質的合成。近年來高光學純度的D-乳酸因為其在合成耐熱性更高、機械強度更好的聚乳酸材料方面的實際應用極大地帶動了D-乳酸的生產研究［1］。微生物發酵法生產D-乳酸，不僅可以解決傳統化學合成法成本高、分離困難等問題，還可以擺脫對石化資源的依賴，減少環境污染［2］。菊糖芽胞乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)是典型的同型發酵D-乳酸的優勢菌株，適合大規模生產高純度的D-乳酸。國內外許多學者對該菌株的菌種改良做了大量研究，取得了一定可喜的成效，但這些研究主要通過誘變篩選結合發酵工藝的優化來獲得高產突變株，存在易退化和生產強度低等缺陷［3－4］。因此，這就需要對該菌株在分子水平上進行解析，進而通過基因工程改造使之更適合于工業化生產的要求。

磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK，EC 2.7.1.11)是糖酵解途徑中的限速變構調控酶，以ATP作為磷酸基供體催化6-磷酸果糖(F-6-P)的磷酸化［5］。筆者所在課題組的前期研究發現，S.inulinus糖酵解代謝流和D-乳酸產量提高的同時，PFK酶活也顯著提高［3，6］。Andersen 等［7］發現乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)PFK酶活的降低將直接導致生長速率和糖酵解代謝流的強烈抑制。但是，關于S.inulinus PFK是如何調控糖酵解和D-乳酸生產還未見報道。PFK對糖酵解代謝流有重要調控作用，通常不同生物來源的PFK有不同的變構調控性質［5］。一般細菌來源的PFK是相對分子質量為3.5×104左右的同源四聚體，ADP或GDP通過提高酶對底物F-6-P的親和力激活該酶，同時磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)對該酶具有顯著的抑制作用［8］。……