系統代謝工程改造樹干畢赤酵母生產琥珀酸

王菲菲，劉 婷，劉立明

(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室 工業生物技術教育部重點實驗室食品微生物制造工程研究室，無錫 214122)

琥珀酸作為一種重要的化工原料，廣泛應用于食品、制藥、農業和化工等領域。同時，還可轉化為其他大宗化學品，具有巨大的潛在市場空間［1］。現在，傳統的琥珀酸生產存在工藝原料短缺、耗資大和環境污染嚴重等問題，限制了其進一步發展。近年來，發酵法生產琥珀酸則逐漸成為國內外研究熱點，主要集中在產琥珀酸放線桿菌［2］、產琥珀酸曼氏桿菌［3－4］、產琥珀酸厭氧螺菌［5］和重組大腸桿菌［6－7］等。然而，由于這些微生物存在發酵、純化工藝復雜等原因，限制了其在工業化生產中的應用［8－10］。樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)是能利用木糖的優勢菌株，而木糖廣泛存在于林業及農業廢棄物中，因此，研究代謝改造樹干畢赤酵母生產琥珀酸對生物質資源的利用具有重要意義。此外，P.stipitis具有耐受低 pH、高糖等優點［11］，能極大地簡化下游工序、降低生產成本，是發酵生產琥珀酸的潛在優勢菌株。

本研究中筆者借助樹干畢赤酵母全基因組代謝網絡模型iTL885［12］，設計琥珀酸最佳合成途徑，進而利用代謝工程策略對樹干畢赤酵母進行代謝改造，以期提高琥珀酸產量。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒

P.stipitis FPL-UC7［13］，由美國威斯康辛大學Jeffries教授惠贈;E.coli JM109，質粒 pY26TEFGPD［14］、pUG72由筆者所在食品微生物制造工程實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

PCR儀(Bio-Rad公司)，高效液相色譜儀(DIONEX UItimate 3000)，5 L發酵罐(上海寶興生物設備工程有限公司)。……