中國南方地區(qū)不育男性Y染色體AZF區(qū)域微缺失分析

李 崎，周 繇，馬 寧，盧偉英，徐 雯，馬燕琳

（海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院海南省人類生殖與遺傳重點實驗室，海南 海口 570102）

中國南方地區(qū)不育男性Y染色體AZF區(qū)域微缺失分析

李 崎，周 繇，馬 寧，盧偉英，徐 雯，馬燕琳

（海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院海南省人類生殖與遺傳重點實驗室，海南 海口 570102）

目的 檢測并分析中國南方地區(qū)不育男性Y染色體上無精癥因子(Azoospermia factor，AZF)區(qū)域的微缺失情況。方法 運(yùn)用多重PCR技術(shù)選用18個STS位點分為四組，設(shè)置空白對照，并采用正常男性DNA標(biāo)本為陽性對照，篩查在海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的1 152例診斷為無精、少精及弱精男性的AZFa、AZFb、AZFc和AZFd 4個區(qū)域的微缺失情況。結(jié)果 1 152例男性患者中共檢出67例AZF微缺失，缺失率為5.8%；其中，無精癥13例，弱精癥1例，少精癥7例，嚴(yán)重少精癥46例。上述患者中60例被檢出AZFc合并AZFd區(qū)或AZFb合并AZFd區(qū)的雙重缺失，1例被檢出AZFc、AZFb合并AZFd區(qū)的三重缺失；就各區(qū)缺失率而言，AZFa為1.49% (1/67)，AZFb為4.48%(3/67)，AZFc為92.54%(62/67)，AZFd為95.52%(64/67)。結(jié)論 采用多重PCR技術(shù)進(jìn)行AZF微缺失檢測十分簡單可行，該項檢測對了解男性不育發(fā)生原因、幫助臨床制定輔助生殖技術(shù)方案十分必要。

多重PCR；無精癥因子；微缺失

育齡夫婦發(fā)生不孕不育的概率為10%～20%，其中約50%由男性因素造成。生精障礙是男性不育的主要原因之一，其受很多因素的影響，如內(nèi)分泌、營養(yǎng)不良、遺傳因素或環(huán)境因素等。1976年，Tiepolo等[1]通過無精癥患者染色體分析發(fā)現(xiàn)其Yq11區(qū)域內(nèi)均存在大片段缺失，推測該區(qū)域可能存在與精子發(fā)生密切相關(guān)的基因或基因簇[1]，后續(xù)的相關(guān)研究陸續(xù)證明了這一觀點。目前，人們將這些基因或者基因簇被稱為無精癥因子(Azoospermia factor，AZF)。AZF因子包含4個區(qū)域，分別為AZFa、AZFb、AZFc和AZFd區(qū)[2-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，在Y染色體長臂區(qū)域包含了眾多的回文結(jié)構(gòu)和插入重復(fù)片段，人們推測這種結(jié)構(gòu)是造成AZF區(qū)域易發(fā)生缺失的可能原因，目前已知，在AZF區(qū)域有近300個STS位點標(biāo)記，這就為檢測AZF區(qū)域的缺失提供了極大的便利[5-7]。筆者選用18個STS位點，采用多重PCR技術(shù)進(jìn)行AZF區(qū)域的微缺失檢測，以研究中國南方地區(qū)男性不育與AZF因子微缺失的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 男性不育患者來自2004-2014年間2 062例來我院遺傳咨詢門診、輔助生育門診就診的患者，經(jīng)精液常規(guī)檢測篩選出1 152例受檢者。無精癥及嚴(yán)重少精癥按第四版WHO精液常規(guī)分析標(biāo)準(zhǔn)確定，連續(xù)3次精液檢查分析并經(jīng)離心沉淀均無精子者診斷為無精癥，精子密度＜5.0×106/ml者為嚴(yán)重少精癥，a+b＜50%或a＜25%為弱精癥。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取受試者外周血3 ml，EDTA抗凝，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，分離得到的白細(xì)胞用蛋白酶K消化，然后采用笨酚-氯仿法抽提，酒精沉淀提取基因組DNA，-20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多重PCR檢測 選用Y染色體上坐落于AZF區(qū)內(nèi)的18個STS位點，分別是AZFa區(qū)的SY81、SY182、SY86，AZFb區(qū)的SY121、SY124、SY127、SY128、SY130、SY133、SY134，AZFd區(qū)的SY145、SY152、SY153，AZFc區(qū)的SY242、SY239、SY254、SY255、SY157。設(shè)立SRY為內(nèi)參對照，并同時設(shè)立正常男性陽性對照及空白對照，分成四組進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增(見表1、表2)。各組的反應(yīng)體系為25μl：含10X緩沖液2.5 μl、dNTPs 0.8 mmol/L、MgCl 21.5 mmol/L、模板100 ng、Taq DNA聚合酶0.5 mmol，引物各10 μmol/L，PCR循環(huán)條件設(shè)置如下：94°C預(yù)變性4 min，30個循環(huán)(95°C 30 s、58°C 30 s、72°C 60 s)，72°C延伸7 min，4°C保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖膠電泳120，45 min。EB染色，觀察結(jié)果。

表1 引物序列

表2 引物分組

1.2.3 結(jié)果判定 若檢測標(biāo)本中陽性對照及所有位點具有擴(kuò)增條帶，且陰性對照及空白對照未見擴(kuò)增條帶，則判斷為無缺失(見圖1)；若待檢標(biāo)本陰性對照及空白對照未見擴(kuò)增條帶，SRY內(nèi)參出現(xiàn)相應(yīng)條帶，而在多重PCR及單獨擴(kuò)增時未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，則判斷該位點缺失。

圖1 三對正常父子的18個STS位點電泳圖

2 結(jié)果

經(jīng)臨床及常規(guī)精液檢測，在2 026例男性中發(fā)現(xiàn)1 152例有精液異常，其中無精癥391例(不明原因)，梗阻性無精癥7例，少弱精癥690例，死精癥6例、單純少精精癥58例。根據(jù)精液檢查結(jié)果將患者細(xì)分為8組，分別命名為A、OA、OⅠ、OⅡ、OⅢ、OⅣ、OⅤ、OⅥ(見表3)。對這1 152例患者進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果顯示，67例被檢出Y染色體AZF區(qū)微缺失，總?cè)笔蕿?.8%，4個區(qū)的缺失發(fā)生率從高到低的排列依次為AZFd(95.52%，64/67)、AZFc(92.54%，62/67)、AZFb (4.48%，3/67)、AZFa(1.49%，1/67)。缺失區(qū)域的組合類型分別為AZFa、AZFb、AZFc、AZFd、AZFbd、AZFcd和AZFcbd(見表4)，且AZFcd出現(xiàn)頻率最高，缺失發(fā)生頻率最高的STS位點為SY239(91.04%)(見表5)。

將精液檢測結(jié)果與AZF缺失檢測結(jié)果結(jié)合起來分析發(fā)現(xiàn)，AZFa區(qū)的缺失僅出現(xiàn)在無精癥患者中，AZFb區(qū)的缺失分別出現(xiàn)在無精癥和少弱精癥患者中，檢出頻率分別為8.3%(1/12，A組)和5.5%(3/54，含OⅠ、OⅡ和OⅢ組)；AZFc區(qū)缺失分別出現(xiàn)在無精癥和少弱精癥患者中，檢出頻率分別為92.3%(12/ 13，A、OA組)和92.5%(50/54，含OⅠ、OⅡ和OⅢ組)；AZFd區(qū)缺失分別出現(xiàn)在無精癥和少弱精癥患者中，檢出頻率分別為84.6%(11/13，A、OA組)和96.2% (52/54，含OI、OⅡ和OⅢ組)。

表3 患者依據(jù)精液檢測結(jié)果分組

表4 各組突變類型統(tǒng)計

表5 STS位點缺失率統(tǒng)計

3 討論

AZF區(qū)域位于Y染色體長臂上，這個區(qū)域發(fā)生的缺失是男性不育發(fā)生的已知重要遺傳因素。采用PCR-STS位點檢測微缺失已經(jīng)成為臨床男性不育檢測的常規(guī)內(nèi)容[8]。

大多數(shù)研究者認(rèn)為AZF包含AZFa、AZFb、AZFc區(qū)，也有學(xué)者認(rèn)為在AZFc和AZFb區(qū)之間還有一個AZFd區(qū)，這個區(qū)域與AZFc和AZFb區(qū)在序列上存在交疊。由于每個區(qū)域包含的生精相關(guān)基因的不同，不同區(qū)域的缺失會有不同的臨床表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，AZFa區(qū)的缺失會影響精原干細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞在精曲小管的生成與分布，該區(qū)域的缺失與無精癥密切相關(guān)；AZFb區(qū)的缺失會影響精原干細(xì)胞在細(xì)胞減數(shù)分裂期的發(fā)展，AZFc區(qū)的缺失會影響精原細(xì)胞向精子細(xì)胞轉(zhuǎn)化，會造成精子生成不足；AZFd區(qū)由于序列與AZFb和AZFc存在交疊，該區(qū)的缺失表現(xiàn)與AZFb和AZFc區(qū)的缺失表型相似[9-11]。

在本研究中，基于精液的常規(guī)檢測結(jié)果將患者分為了8個組，并在其中的5個組檢測出AZF區(qū)缺失。在1 152例男性不育的患者中，AZF區(qū)缺失檢出率為5.8%，其中，391名A組中檢出了12例缺失患者，缺失檢出率為3.1%；在7例梗阻性無精癥患者中，發(fā)現(xiàn)了1例患者攜帶AZF的缺失，提示梗阻性無精癥患者同樣也存在攜帶基因缺陷的可能；在少精癥(OⅠ和OⅡ組)和嚴(yán)重少精癥(OⅢ組)患者中的缺失檢出率分別為2.4%和13.1%，值得注意的是，在OⅠ、OⅡ、OⅢ組患者并非單純的少精，同時還表現(xiàn)出不同程度的精子活力減退，而在OⅤ和OⅥ組中，并未檢出AZF區(qū)的缺失，精液常規(guī)檢測表明，這兩個組的精子活力正常，相關(guān)結(jié)果提示，AZF區(qū)域的基因不僅與精子的發(fā)生相關(guān)，還可能影響精子的活動力。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在缺失區(qū)域AZFd區(qū)的缺失發(fā)生率最高，為95.52%，然后依次為AZFc(92.54%)、AZFb(4.48%)和AZFa(1.49%)；STS位點缺失檢出率最高的為SY239(91.04%)，然后依次為SY254 (89.55%)、SY255(89.55%)、SY242(88.06%)、SY242 (88.06%)、SY153(88.06%)，這些位點全部都分布在AZFc和AZFd區(qū)，通過序列比對得知，這些位點在Y染色體上都有多個拷貝，拷貝數(shù)從2～7不等(表5)，這也許就是缺失率高發(fā)的原因之一。

Y染色體微缺失的檢測幫助我們在一個新的層面上了解了男性不育的發(fā)病原因，并開始幫助臨床治療。目前越來越多的人已經(jīng)認(rèn)識到AZF微缺失給人們的生育帶來的困擾，并開始尋求相應(yīng)的技術(shù)手段幫助這一類患者解決生育方面的問題，提供相關(guān)咨詢，我們有理由相信AZF微缺失檢測將會為越來越多的人提供幫助。

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Y chromosome AZF region microdeletions in infertile males in south China.

LI Qi,ZHOU Yao,MA Ning,LU Wei-ying,XU Wen,MA Yan-lin.Hainan Provincial Key Laboratory for Human Reproductive Medicine and Genetic Research,the Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA

Objective To detect and analyze the microdeletions of Y chromosome Azoospermia factor (AZF)region in infertile males in South China.Methods A total of 1 152 infertile males with azoospermia and oligozoospermia from Reproductive Medicine Center of the Affiliated Hospital of Hainan Medical University were enrolled and tested for microdeletions of AZFa,AZFb,AZFc and AZFd regions in Y chromosome.Eighteen sets of STS primers were selected and divided to four groups for multiplex polymerase chain reaction(PCR)to determine Y-chromosome microdeletions.Blank controls and positive controls(healthy male's DNA)were included in every PCR experiment. Results Among the 1 152 patients,67(5.8%)were found at least one microdeletion in AZF regions,including 13 cases of azoospermia,1 case of asthenozoospermia,7 cases of oligozoospermia and 46 cases of severe oligozoospermia. Sixty patients had deletions in twoAZF regions:AZFc combined withAZFd orAZFb combined withAZFd.One patient had deletions in three AZF regions:AZFc combined with AZFb and AZFd.The rates of deletions were 1.49%(1/67)for AZFa,4.48%(3/67)for AZFb,92.54%(62/67)for AZFc,and 95.52%(64/67)for AZFd.Conclusion Multiplex PCR is a fast,simple and convenient way to analyze Y chromosome microdeletions,which could help us to understand the real cause of male infertility and provide advice for choosingART strategy.

Multiplex PCR;Azoospermia factor;Microdeletion

R698+.2

A

1003—6350（2014）18—2656—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1044

2014-08-13)