細胞穿透肽TAT融合小鼠nNOS1-133重組蛋白的表達純化及藥效學研究*

朱珠，張宇，朱東亞

南京醫科大學藥學院，南京　211166

細胞穿透肽TAT融合小鼠nNOS1-133重組蛋白的表達純化及藥效學研究*

朱珠，張宇，朱東亞**

南京醫科大學藥學院，南京211166

摘要目的：表達、純化有活性的TAT-nNOS1-133重組蛋白，并初步驗證其神經保護作用；為開發新神經保護藥物提供理論基礎。方法：通過PCR、酶切和酶連的方法構建pET28a-TAT-nNOS1-133重組質粒，并轉化入大腸桿菌中表達。表達產物經洗滌、復性、陰離子交換柱（DEAE-52）、超濾純化并除鹽。通過FITC標記目的蛋白評價其能否進入細胞，并通過檢測細胞凋亡評價TAT-nNOS1-133對谷氨酸誘導的興奮性毒性的保護作用。結果：獲得了較高純度的TAT-nNOS1-133重組蛋白，經SDS-PAGE電泳顯示相對分子質量在17 kD附近有單一條帶，且與理論分子質量一致。TAT-nNOS1-133可以進入神經細胞，并減少了谷氨酸誘導的PI陽性細胞數增多。結論：成功構建了TAT-nNOS1-133的原核表達系統并建立了其分離純化方案。TAT-nNOS1-133可以進入細胞并且減輕了腦卒中病理模型谷氨酸誘導的興奮性毒性。

關鍵詞TAT-nNOS1-133；分離純化；腦卒中；重組蛋白

腦卒中是危害中老年人身體健康與生命的臨床常見重大疾病,具有較高的致殘率和死亡率,其中缺血性腦卒中占了相當大的比例。腦缺血時,腦血流的降低會導致神經元功能活動受到影響,進而造成對神經元有害的一系列事件發生,其中谷氨酸誘導的興奮性毒性是造成神經元死亡的重要因素。缺血狀態下腦內谷氨酸大量釋放,持續激活神經元上的N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDAR),從而誘導神經元死亡。NMDAR介導的神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)激活是NMDA受體介導細胞死亡的關鍵事件[1]。

圍繞NMDAR和nNOS這兩個靶分子開發了許多藥物,例如NMDAR非競爭性拮抗劑MK-801,能減少半暗帶內鈣離子內流,從而減少腦組織缺氧損傷[2-3]；選擇性nNOS抑制劑7-硝基吲唑,可以降低缺血誘導腦梗死面積,從而起到神經保護作用[4-5]。雖然針對這兩個靶點開發了一系列藥物,但是NMDA受體和nNOS在正常生理情況以及損傷保護、修復中都起到關鍵性作用,因此這些藥物大多數會引起難以忍受的副作用,比如擬精神作用、惡心、嘔吐、學習記憶損傷、攻擊行為,甚至神經細胞壞死等[6-7]。

因此,關注焦點被轉移到介導神經元死亡事件的下游信號。NMDAR受體介導的神經元死亡過程中突觸后密度蛋白PSD95(postsynaptic density protein 95)與nNOS的偶聯增加,從而使nNOS被募集到NMDA受體附近并激活,這是NMDA受體引起興奮性毒性的重要途徑之一[8]。但是由于突觸AMPA受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor)及神經元的功能需要PSD95的參與,因此直接干擾PSD95依然會帶來較大的副作用[9]。在興奮性毒性損傷過程中影響nNOS向NMDA受體或PSD95的過度聚集可以避免直接干預NMDA受體、PSD95和nNOS活性所帶來的嚴重副作用。

本研究通過基因工程方法將nNOS中與PSD95偶聯所需的結構域(nNOS1-133)與人免疫缺陷病毒細胞穿透肽(TAT)融合表達,使該重組蛋白能透過細胞膜,并在細胞中與nNOS競爭結合PSD95,降低NMDA受體介導的nNOS過度活化,從而對興奮性毒性損傷起到治療作用。

1　材料與方法

1.1材料

限制性內切酶NcoⅠ、Hin dⅢ及T4 DNA連接酶購自Takara公司；質粒小量提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、Pfu酶、DNA Marker、異硫氰酸熒光素(FITC)、引物合成和DNA測序服務均來自上海生工生物工程技術服務有限公司；蛋白質Marker購自Fermentas公司；無血清神經細胞培養基(Neurobasal)、B27神經細胞生長添加劑和12孔培養板均購自Gbico公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；其它試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1重組基因工程菌的構建利用PCR方法從小鼠神經元cDNA中擴增出nNOS1-133基因片段,并通過引物在nNOS1-133基因的5'端加入TAT基因片段,在5'端和3'端分別加入NcoⅠ和Hin dⅢ酶切位點。PCR條件為：94℃預變性5min；94℃變性1 min,65℃45 s,72℃1 min進行30個循環；72℃10min；冷卻至4℃結束反應。所用引物序列如下：

對PCR得到的片段及載體pET28a進行NcoⅠ和Hin dⅢ雙酶切,于4℃連接12 h后轉化到BL21 (DE3)感受態細胞中,重組質粒構建如圖1。轉化液涂布于含50μg·m L-1的LB平板上過夜培養,挑取轉化子單菌落,培養4 h后加入乳糖誘導6 h。取1m L菌液離心收集菌體,加入60μL 1×Loading Buffer,煮沸5min,菌體裂解物經15%SDS-PAGE檢測。并對有分子量相符產物表達的陽性克隆進行測序。

1.2.2TAT-nNOS1-133重組蛋白的誘導表達將測序正確的含pET28a-TAT-nNOS1-133的重組基因工程菌按1∶100接種于含50μg·mL-1卡那霉素的LB培養基中,37℃180 r·mim-1恒溫振蕩培養,并于0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8 h測定培養液在600 nm的吸光度值OD600。對數生長期的中后期加入誘導劑乳糖至終濃度5mmol·L-1,誘導6 h,離心收集菌體。

1.2.3TAT-nNOS1-133重組蛋白的復性及純化每10 g菌體重懸于100mL菌體裂解緩沖液[50mmol· L-1Tris-HCl,pH 8.0,60μg·mL-1溶菌酶,0.5%TritonX-100,10 U·mL-1DNA酶Ⅰ,1mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)]中,-20℃凍融兩次。4℃,12000 r· min-1離心10min,分別收集上清液及沉淀,15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析重組蛋白表達形式。

圖1　重組表達質粒pET28a-TAT-nNOS1-133構建流程圖

每10 g包涵體加入50m L Tris-HCl(50mmol· L-1,pH 8.0)洗滌3次,繼續用含有0.5%TritonX-100的Tris-HCl(50mmol·L-1,pH 8.0)洗滌2次。得到的包涵體經包涵體裂解液(8mol·L-1尿素,50mmol·L-1Tris-HCl,pH 8.0,每10 g包涵體加入50mL裂解液)混懸,4℃攪拌過夜。12000 r·min-1離心10min,棄沉淀。上清液上樣于經過包涵體裂解液平衡好的陰離子交換柱(DEAE-52纖維素)中,并用包涵體裂解液洗滌4個柱床體積,然后逐步將包涵體裂解液換成復性緩沖液(50mmol·L-1Tris-HCl,pH 8.0,5 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽,0.5mmol·L-1還原性谷胱甘肽及10%甘油,流速0.2mL·min-1),在洗滌液轉變為復性緩沖液后,繼續采用復性緩沖液沖洗50倍柱床體積(流速0.2mL·min-1)。

用洗滌緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl,pH 8.0,10mmol·L-1NaCl)洗滌至基線,含有10～150mmol· L-1NaCl的洗滌緩沖液為洗脫液進行線性洗脫。分部收集洗脫液,樣品經15%SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮藍染色鑒定吸收峰組分蛋白質組成。首先純化產物通過透析除鹽,隨后經超濾去除大于30 kD的雜質并凍干。

1.2.4原代神經元培養取15天左右胎鼠,夾取皮層并剝除腦膜,經D-Hanks漂洗后剪碎,0.125%胰酶37℃消化10min后終止,1500 r·min-1離心10min棄去上清液。沉淀用2 mL神經元培養基(neurobasal,2%B27,100U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素)重懸后過400目篩網,以1×105/cm2接種,培養8天后用于實驗。

1.2.5異硫氰酸熒光素（FITC）標記TAT-nNOS1-133蛋白TAT-nNOS1-133溶于交聯反應液(0.756%碳酸氫鈉、0.106%碳酸鈉、0.736%氯化鈉),在避光條件下按1 mg蛋白質∶150μg FITC的比例緩慢加入FITC,室溫下避光攪拌12 h,透析去除多余的FITC并將溶液置換為磷酸緩沖液(PBS)。取原代培養第四天神經元,加入不同濃度標記混合物,于37℃孵育1 h,熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6細胞凋亡與壞死檢測取第8天原代神經元,0.1μmol·L-1TAT-nNOS1-133孵育45 min后,給予谷氨酸刺激1 h后,培養基更換為含Hoechst 33342以及碘化丙啶(PI)的新鮮培養基,4℃孵育20min,PBS洗滌2次,于20倍熒光顯微鏡下隨機選取10個視野,計算PI、Hoechst雙陽性細胞占總細胞的比例。

2　結果

2.1TAT-nNOS1-133重組工程菌的鑒定

陽性克隆經乳糖誘導表達后經SDS-PAGE電泳分析,初步篩選出表達TAT-nNOS1-133重組蛋白的重組工程菌,經測序驗證選取序列完全正確的克隆作為生產用工程菌(見圖2)。

圖2　重組工程菌pET28a-TAT-nNOS1-133/BL21（DE3）的鑒定

2.2TAT-nNOS1-133重組工程菌生長曲線測定

在重組工程菌活化和培養后第0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8 h分別取樣測定OD600(圖3A),該重組工程菌基本符合S型生長曲線。

2.3TAT-nNOS1-133重組蛋白誘導表達及純化

圖3　重組工程菌pET28a-TAT-nNOS1-133/BL21（DE3）生長曲線和誘導表達曲線的測定

根據生長曲線,選擇對數生長期的中后期即3.5 h加入乳糖誘導,誘導后不同時間取樣,經SDSPAGE電泳檢測分析,在誘導后4 h表達量達到穩定,在分子量16 kD附近有明顯蛋白表達,與理論分子量相符(見圖3B)。裂解后產物經SDS-PAGE電泳表明目的蛋白主要以包涵體的形式表達,包涵體經過洗滌、裂解獲得初步純化的TAT-nNOS1-133重組蛋白(見圖4)。復性后產物經DEAE-52陰離子交換樹脂進一步純化,并通過超濾除去部分雜質獲得了較高純度的TAT-nNOS1-133(見圖5)。

2.4TAT-nNOS1-133的活性及藥效學評價

將體外培養第8天的神經元與FITC標記的TAT-nNOS1-133(50 nmol·L-1)共孵育,45min后可檢測到細胞中的熒光(見圖6),說明TAT-nNOS1-133可以順利地穿過細胞膜。

谷氨酸誘導的興奮性毒性模型中,谷氨酸造模組與溶劑對照組相比凋亡細胞比例顯著增高,而給予TAT-nNOS1-133(100 nmol·L-1)可以明顯減少雙陽性細胞數(見圖7)。說明TAT-nNOS1-133可以穿過細胞膜并且在一定程度上降低了谷氨酸誘導的細胞凋亡與死亡。

3　討論

腦卒中具有高發病率、高致殘率、高復發率及高致死率的特點,屬于臨床重大疾病。NMDA受體作為門控離子通道復合物起到控制興奮性氨基酸遞質傳遞的重要作用,病理研究發現腦缺血時產生持續性神經元去極化,NMDA受體過度激活,通過PSD95介導的nNOS偶聯增加造成nNOS過度活化,催化合成大量一氧化氮,進而致使神經元死亡。雖然大量研究表明NMDA受體拮抗劑或nNOS抑制劑可以減輕缺血性腦損傷,但是它們還同時阻斷了NMDA受體和nNOS的正常生理功能。所以我們將目光投向了NMDA受體-PSD95-nNOS三聯復合物上,希望通過解開三者的偶聯來發揮保護作用。

圖4　重組蛋白TAT-nNOS1-133包涵體洗滌條件的確定

圖5　重組蛋白TAT-nNOS1-133的純化

圖6　重組蛋白TAT-nNOS1-133對原代培養皮層神經元的轉導

圖7　原代培養皮層神經元模型中重組蛋白TAT-nNOS1-133減輕了谷氨酸誘導的興奮性毒性

nNOS通過其N端PDZ結構域(第1至100個氨基酸)與PSD95相互作用,并且N端1到133個氨基酸區域中不包括nNOS催化位點,如果能將nNOS1-133導入細胞內,就能達到競爭性結合的目的,從而減少對內源性nNOS的活化。TAT是人免疫缺陷病毒穿膜結構域的最小片段,TAT可以攜帶與其融合的蛋白質或片段穿過血腦屏障及細胞膜進入細胞內。因此本研究構建并分離純化TAT-nNOS1-133,通過提高神經元內無催化功能的nNOS1-133片段濃度來減少腦缺血過程中興奮性毒性導致的神經元死亡。

TAT-nNOS1-133重組蛋白分子量較大并不適宜用化學合成的方法生產,只能通過生物合成的方式得到,而大腸桿菌具有費用低廉、易于培養、重組蛋白表達量高且穩定等優點[10]。本研究構建了pET-28a-TAT-nNOS1-133重組質粒,在大腸桿菌E.coli BL21中表達,利用乳糖成功誘導表達了重組蛋白TAT-nNOS1-133。重組蛋白以包涵體的形式存在,通過柱復性的方法對包涵體進行復性。透析和稀釋是目前最常用的兩種復性方法,但易造成蛋白聚集,目的蛋白的回收率偏低[11]。我們曾采用極緩慢的加入復性液的方法進行稀釋復性,但是蛋白回收率及活性仍然很低。因此采用離子交換柱復性法,由于蛋白質結合在固相介質上可以減少相互間碰撞概率,因此減少了復性折疊過程中蛋白的聚集沉淀,可以提高復性的效率和產率。復性后蛋白經梯度洗脫、超濾等步驟,獲得了純度較高的重組蛋白。TAT-nNOS1-133是一個堿性蛋白質,其等電點約為10.34,與常見蛋白質相比復性更加困難,本研究最終獲得復性后產物的純度約為97%,且產率有了顯著的提高,由稀釋復性的31%提高到52%,接近劉建波等人使用多種復性方式對常規蛋白的復性效率[12]。在藥效學評價中顯示,該重組蛋白可以進入細胞并減輕了谷氨酸誘導的細胞凋亡及死亡。這就為針對此靶點的藥物基礎理論研究和發展各類中西新藥,提供了研究基礎和新的思路。

參考文獻

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[12] 劉建波,于占江,鄧玲娟,等.重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子復性和純化方法的比較[J].生物技術通報,2009,12：108-11.

**通訊作者朱東亞，男，博士生導師E-mail：dyzhu@njmu.edu.cn

中圖分類號R971;Q 78

文獻標志碼A

文章編號1673-7806(2014)01-015-05

*基金項目江蘇省高校自然科學研究項目（11KJB180007）

作者簡介朱珠，女，在讀碩士E-mail：zhuzhu@njmu.edu.cn

收稿日期2013-12-19修回日期2013-12-25

Prokaryotic Expression,Purification and Pharmacodynamics Research of the Recombinant Protein Containing Cell-penetrating TAT Peptide and nNOS1-133*

ZHU Zhu,ZHANG Yu,ZHU Dong-ya**
School of Pharmacy,Nanjing Medical University,Nanjing 211166,China

ABSTRACTObjective：The expression and purification of the recombinant protein TAT-nNOS1-133and its effects were investigated.Methods：The prokaryotic expression vector pET28a-TAT-nNOS1-133was constructed and transformed into the expression strain of E.coli BL21(DE3).Subsequently,the transformed bacteria were induced by lactose for expression of the recombinant protein.The recombinant protein accumulated mainly in inclusion body was purified by the sequential application of washing,renaturation,ion exchange and ultrafiltration.The transduction of the fusion protein labeled with FITC(FITC-TAT-nNOS1-133and FITC-BSA)in cortical neurons in vitro and its neuroprotective effects were also investigated.Results：SDS-PAGE revealed that tthe recombinant protein TAT-nNOS1-133was of high purity.TAT-nNOS1-133 can get into neurons and protect neurons against neurotoxicity.Conclusion：TAT-nNOS1-133can be successfully expressed in prokaryotic expression system and it protects neurons in vitro.

KEY WORDSTAT-nNOS1-133;Purification;Stroke;Recombinant protein