心臟冰凍切片ABC法免疫熒光染色中不同封閉方法對比

【摘要】 目的 比較心臟冰凍切片ABC（Avidin-Biotin Complex）法免疫熒光染色中不同封閉方法對染色結果的影響。 方法 制作心肌梗死后心臟組織冰凍切片，分別以內源性生物素封閉液（A組）、5%BSA（B組）封閉非特異性染色，其余切片不封閉（C組），然后以生物素-親和素抗體行免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察。 結果 A組切片無背景染色，B、C組有較多非特異性染色。 結論 心臟冰凍切片ABC法免疫熒光染色封閉內源性生物素可獲得滿意染色效果。

【關鍵詞】 ABC法；免疫熒光技術；封閉；心臟

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.03.574 文章編號：1004-7484（2014）-03-1463-02

常規的免疫組化ABC法首先以一抗與組織切片相應抗原結合，再將生物素標記的二抗與一抗通過抗原-抗體反應結合，最后加入過氧化物酶-親和素復合物與生物素結合后顯色[1]。因其較高的親和力及特異性常被大量用于石蠟切片免疫組織化學染色中。然而，目前將ABC法用于心臟冰凍切片免疫熒光染色的研究較少。因此，我們采用ABC法行免疫熒光染色，并對幾種不同的封閉方法對染色結果的影響做了對比。

1 資料與方法

1.1 動物模型建立 根據參考文獻[2]方法建立SD大鼠心肌梗死模型，于模型建立后第三天斷頸處死，取出心臟制作冰凍切片備用。

1.2 ABC法免疫熒光染色

1.2.1 內源性生物素封閉液配制 根據參考文獻[4]：取1枚雞蛋蛋清，加入PBS100ml充分混勻，即為內源性生物素封閉液。

1.2.2 染色步驟 1冰凍切片以不同方法封閉：將切片分為A、B、C三組，A組封閉內源性生物素，先將切片置于內源性生物素封閉液中室溫浸泡20min，PBS洗，再滴加5%脫脂奶室溫孵育20min，PBS洗；B組采用5%BSA室溫封閉1小時；C組，不加封閉液，滴加PBS室溫孵育1小時。②滴加biotin標記單克隆抗c-kit50ul，4度孵育過夜。③PBS洗5min×3次，滴加CY3-avidin50ul，室溫避光孵育60min，PBS洗5min×3次。④DAPI復染5min，PBS洗3min×3次。⑤抗熒光衰減劑封片。⑥熒光顯微鏡下觀察，陽性染色激發紅色熒光。

2 結 果

不同封閉方法中，A組采用內源性生物素封閉液封閉，染色效果最佳，無非特異性背景染色。而采用5%BSA封閉的B組及滴加PBS的C組雖也可見發紅色熒光的c-kit陽性細胞，但均可見較多非特異性染色，影響染色效果，見圖1。

3 討 論

生物素是一種B族維生素，廣泛存在于全身多個組織器官中，尤以腎臟、肝臟、脾臟較多，當對這些器官采用ABC法免疫組化染色時，可能產生較高的非特異性背景染色。ABC法利用了生物素與親和素的高度親和力，被廣泛應用于石蠟切片的免疫組化染色中。因其行抗原修復過程中可增加石蠟切片內源性生物素影響結果，因此常需封閉內源性生物素以獲得滿意結果。理論上心臟中內源性生物素含量較少，且本實驗中我們選取的冰凍切片無需抗原修復，因此我們試圖觀察心臟冰凍切片免疫熒光是否需要封閉內源性生物素。

免疫熒光染色多采用一抗與二抗間抗原抗體反應原理，常以5%BSA封閉組織中自帶的非特異性抗原，本實驗觀察了對于采用生物素-親和素抗體系統的冰凍切片免疫熒光染色，5%BSA封閉是否能夠起到封閉內源性生物素的作用。結果發現，采用5%BSA封閉與不封閉組的切片均可見較高的非特異性背景染色，說明5%BSA對內源性生物素并無封閉作用，而且雖然心臟生物素含量少，但其仍能影響染色效果，而封閉內源性生物素后則幾乎無背景染色。因此對于心臟冰凍切片ABC法免疫熒光染色不需使用5%BSA封閉，而需封閉內源性生物素才可獲得較滿意結果。

參考文獻

[1] 巴迎春，王廷華，李明.用免疫組化ABC法的漂片法做好腦片實驗的體會[J].四川解剖學雜志，2006，14（1）：58-59.

[2] 許官學，石蓓，盛瑾，郭小英，楊文筆，雷艷娟.改良大鼠急性心肌梗死模型的制備方法[J].中國老年學雜志，2013，33（14）：3367-3370.

[3] Miller，R.T.Blocking of Endogenous Avidin-Binding Activity in Immunohistochemistry：The Use of Egg Whites[J].Applied Immunohistochemistry，1997，（1）：63-66.

[4] 王永軍，王珩，王小玲，劉世正.內源性生物素對免疫組化染色的影響及消除方法[J].臨床與實驗病理學雜志，2005，21（6）：735-736.