丙泊酚對大鼠腦缺血損傷后凋亡神經元線粒體CytC和ATPase的影響

摘要：目的 探討丙泊酚對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬區凋亡神經元線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和細胞色素C（CytC）的影響。方法 36只雄性SD大鼠隨機分為假手術組，模型組和丙泊酚組（n=12），復制大鼠全腦缺血再灌注模型，采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠腦海馬區CytC表達；采用比色法測定大鼠腦海馬區凋亡神經元線粒體ATPase的改變。結果 與假手術組比較，模型組和丙泊酚組CytC的表達均增加（P<0.05），ATP酶的活性均降低（P<0.05）；丙泊酚組大鼠腦組織海馬區CytC的表達低于模型組（P <0.05），ATP酶的活性高于模型組（P <0.05）。結論 丙泊酚的神經保護與改善腦缺血損傷后海馬區凋亡神經元CytC的釋放和ATPase的活性有關。

關鍵詞：丙泊酚；腦缺血；細胞凋亡；細胞色素C；ATP酶

腦缺血再灌注損傷-凋亡反應機制在損傷中的作用日益受到關注[1]。丙泊酚為臨床常用靜脈麻醉藥，研究證實丙泊酚具有神經保護作用[2，3]，但在線粒體水平的作用機制研究報道較少。本研究擬觀察觀察丙泊酚對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡神經元線粒體CytC及ATPase的影響，進一步探討丙泊酚對腦缺血損傷的神經保護作用機制。

1 資料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性清潔級SD大鼠 36只，體重250～300g，由濰坊醫學院實驗動物中心提供。隨機分為假手術組，模型組和丙泊酚組（n=12）。

1.2動物模型制備 大鼠術前16h禁食。 腹腔注射 3%戊巴比妥鈉45mg·kg-1麻醉后，分離雙側頸總動脈，然后用無損傷微動脈夾同時阻斷雙側頸總動脈血流造成腦缺血，檢查遠端血流情況以確保完全阻斷血流。腦缺血時間為10 min，松開動脈夾恢復腦血流即為再灌注。丙泊酚組在再灌注即刻經舌靜脈泵注丙泊酚 20 mg·kg-1·h-1，模型組給予等量生理鹽水代替，持續2 h。再灌注 2 h后處死大鼠取海馬。

1.3 CytC和ATPase的檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測神經細胞內CytC（美國RD Rat Cytochrome-C Elisa測定試劑盒）；應用比色法測定Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase（南京建成生物工程研究所ATP酶試劑盒）。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件分析，所有數據均應用x±s表示，采用方差分析t檢驗，以P<0.05為有統計學意義。

2結果

與假手術組比較，模型組和丙泊酚組CytC的表達均增加（P<0.05），Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+ATP酶的活性均降低（P<0.05）；丙泊酚組大鼠腦組織海馬區CytC的表達低于模型組（P<0.05），Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+ATP酶的活性。

注：與假手術組比較，* P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3 討論

缺血后神經元可有凋亡和壞死兩種形式，其共同的機制在于各種因素引起的線粒體功能的變化，這些因素包括ATP耗竭、CytC表達的改變等[4]。CytC是線粒體外膜腔隙的一種水溶性蛋白質，在線粒體呼吸鏈中起電子傳遞作用[5]，諸多研究表明CytC與病理狀態下神經細胞的凋亡過程有著密切的聯系[6]，CytC在缺氧條件下從線粒體中釋放到胞漿通過激活半胱天冬酶而導致神經細胞的凋亡[7]。細胞凋亡時，線粒體的結構和功能發生重大變化，包括呼吸鏈電子傳遞的中斷、能量合成受阻、線粒體膜電位下降，并釋放促凋亡因子[8]，導致細胞死亡。其中CytC是線粒體釋放的最重要的促凋亡因子之一。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是廣泛分布在機體內的生物膜酶系統，它們對維持細胞的正常生理功能起著極其重要的作用。繼發性腦缺血、缺氧可造成Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的降低[9]，在這些因素的作用下，線粒體及細胞發生一系列級聯反應和變化，最終導致細胞凋亡。本實驗研究發現在腦缺血再灌注損傷后海馬區神經元線粒體CytC的表達增加，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低，說明海馬區神經元出現線粒體凋亡。丙泊酚進行干預可減輕腦缺血再灌注損傷后海馬區神經元CytC的釋放，CytC的表達明顯減少；并且在大鼠腦缺血再灌注損傷后線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性雖仍高于假手術組，但較模型組明顯降低，說明丙泊酚可提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，可減輕神經細胞的凋亡。

總之，丙泊酚對腦缺血損傷的神經元保護與改善海馬區凋亡神經元CytC的釋放和Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性有關，在線粒體水平上進一步探討了丙泊酚的腦保護作用。

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編輯/王海靜