SiRNA干擾介導CXCR4基因沉默在抑制惡性淋巴瘤 轉移中作用及機理

摘要：目的 本研究擬通過RNA干擾技術抑制CXCR4基因的表達，并觀察其對淋巴瘤細胞侵襲轉移能力的影響。方法 設計合成CXCR4 特異性小干擾RNA（siRNA），并轉染JURKAT細胞。通過qPCR檢測CXCR4 mRNA 的表達，用Transwell小室體外細胞侵襲模型檢測細胞體外侵襲能力。結果 轉染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-siRNA的JURKAT細胞CXCR4基因表達明顯受抑制；與對照組比較，其細胞侵襲能力亦明顯降低。結論 應用RNA干擾靶向沉默技術，高效特異性地抑制淋巴瘤細胞CXCR4 基因的表達，從而抑制腫瘤的侵襲能力。

關鍵詞：惡性淋巴瘤；siRNA ；CXCR4

惡性淋巴瘤是一組原發于淋巴結和（或）結外部位淋巴組織的淋巴細胞或組織細胞的惡性腫瘤。本研究擬通過RNA干擾技術，靶向沉默CXCR4基因的表達，觀察其對淋巴瘤侵襲轉移的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑 人淋巴瘤細胞株JURKAT由南方醫科大學南方醫院血液病實驗室惠贈；pRNAT-U6.2/Lenti購于GenScript公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購于QIAGEN公司。

1.2細胞培養 JURKAT細胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養液，于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，常規換液傳代。

1.3質粒載體的構建 利用Takara、AMbion和Promega siRNA靶序列分析設計系統，掃描人CXCR4 cDNA編碼序列，依據siRNA靶序列設計原則，經BLAST同源性分析。設計包含XholⅠ和BamHⅠ酶切殘端的1對靶向CXCR4發卡樣DNA寡核苷酸，由上海生工公司分別合成2對編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，其序列如下：5'-GATCC GGAACCCTGTTTCCGTGAATTCAAGAGA TTCACGGAAACAGGGTTCC TTTTTTC-3' （sense） and 5'-TCGAG AAAAAA GGAACCCTGTTTCCGTGAA TCTCTTGAA TTCACGGAAACAGGGTTCC G-3' （antisense）。 選取其中一個序列打亂并無基因同源性作為陰性對照序列（NC）。其寡核苷酸序列：5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3' （sense） and 5'-ACGTGACACGTTCGGAGAAT-3' （antisense），用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切空質粒pRNAT-U6.2/Lenti，將退火形成的雙鏈定向克隆至該真核載體上，經篩選后，再進行測序鑒定。

1.4質粒轉染及穩定篩選 參照Lipofectamine TM2000轉染試劑盒說明書進行轉染，通過脂質體將表達載體（pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA）和空質粒（pRNAT-U6.2/Lenti）轉染入JURKAT細胞，經G418篩選建立穩定傳代的細胞系。

1.5熒光定量PCR檢測CXCR4 mRNA表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，用AMV反轉錄酶進行反轉錄，得到總cDNA。分別擴增目的基因CXCR4及內參對照 -actin，引物序列如下：CXCR4上游引物5'- CAATGACTTGTGGGTGGTTGTG-3'，下游引物5'- ATGCAATAGCAGGACAGGATGA -3'； -actin上游引物5′- TGGCACCCAGCACAATGAA -3′，下游引物5′- CTAAGTCATAGTCCGCCTAG

AAGCA -3′。擴增條件：95℃預變性30s，95℃變性3s，60℃退火和延伸30s，循環40次。記錄各管擴增CT值，換算出基因拷貝數。以CXCR4基因拷貝數與 -actin基因拷貝數的比值作為CXCR4相對表達水平。

1.6 Transwell小室侵襲實驗 以預冷的RPMI1640與Matrigel膠1：1稀釋后，取100μl稀釋膠加到Transwell上層小室中，于37℃孵育6h。收集各組細胞，消化成單細胞懸液，用含1%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸，按5×104/ml個細胞的密度將100μl接種于Transwell上層小室。吸取含10%胎牛血清或10%胎牛血清+100ng/ml SDF-1的RPMI1640培養基500μl加入Transwell下層小室，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養24h。用棉簽沾PBS輕輕地擦去小室上層聚碳酸酯膜上貼壁生長但未能穿過膜的細胞。將膜取出放入預先裝有95%乙醇的24孔板內固定10min。吸棄乙醇，加0.1%的結晶紫染色30min，用PBS小心洗去多余的染料，翻轉聚碳酸酯膜，小心撕下，晾干，置載玻片上加中性樹膠蓋玻片封片。在200倍放大倍數下隨機觀察并計10個視野內穿過聚碳酸酯膜的細胞數，照相記錄。重復3次。

1.7統計學方法 SPSS16.0軟件進行統計學處理，各組間比較應用單因素方差分析，檢驗標準以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 JURKAT細胞CXCR4 mRNA的表達 轉染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA的JURKAT細胞中CXCR4 mRNA表達水平均明顯降低，與空載體組和空白組相比，差異有統計學意義（P<0.01）。而空載體組和空白組相比差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2各組JURKAT 細胞體外侵襲能力 空白對照、陰性對照、siRNA 轉染組JURKAT細胞的穿膜細胞數分別為（109.30±8.03）、（107.80±9.51）、（54.60±10.06） ，3者比較，差異有統計學意義（F=126.356，P<0.001）。siRNA 轉染組JURKAT細胞的穿膜細胞數明顯低于空白對照和陰性對照組（P<0.05）。

圖1 CXCR4靶向沉默對淋巴瘤細胞JURKAT侵襲能力的抑制作用

3討論

基質細胞衍生因子-1 （ SDF-1）是趨化因子CXC亞家族的重要成員之一，又名CXCL12，它與其特異性的G蛋白偶聯受體CXCR4 具有高度的親和性。現有的研究表明， SDF-1與CXCR4所構成的受配體系統不僅在細胞的炎癥反應、造血干細胞的遷移與歸巢等生物學過程中發揮著重要的作用，而且還可能在腫瘤尤其是血液腫瘤的發生以及浸潤等環節起著一定的作用[1]。腫瘤轉移是一個具有高度組織性和器官選擇性的復雜連續過程。雖然已證明很多因素參與腫瘤的轉移，但是，不同組織來源的腫瘤細胞遷移、侵襲到特定部位的分子機制還不清楚。研究發現，CXCR4在惡性淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、肺癌、卵巢癌、膠質瘤等腫瘤細胞中的表達增高，CXCR4與其配體SDF-1的相互作用可能在其侵襲轉移中發揮著重要作用，因此推斷抑制腫瘤細胞表面CXCR4 的表達，干擾SDF-1/CXCR4 的相互作用可能是抗腫瘤侵襲轉移的一個比較有意義的靶點和策略。

siRNA可以特異性地剔除或關閉特定基因的表達，被廣泛應用于基因功能探索和惡性腫瘤的基因治療。國外學者用siRNA封閉CXCR4基因后使乳腺癌細胞的侵襲和粘附能力明顯下降，將封閉CXCR4基因后的乳腺癌細胞種植入SCID小鼠中可阻止腫瘤的發生，從而說明CXCR4可能控制乳腺癌生長和轉移的潛在靶點。

淋巴瘤臨床分期是依據腫瘤對淋巴結區和（ 或） 結外器官侵犯范圍和程度不同來劃分，而臨床分期和結外器官受侵的數目與患者的預后明顯相關。Trentin 等[2]對21 例非霍奇金淋巴瘤（NHL） 患者研究發現，CXCR4 是唯一在所有患者惡性B細胞均有表達的趨化因子， 并且SDF-1 對此類細胞有趨化作用。用CXCR4 抗體或SDF-1 抗體可抑制NHL 細胞的跨內皮細胞和跨基質細胞遷移，并且抑制其增殖和促進其凋亡[3]。動物實驗則發現NOD/SCID小鼠注射Namalwa 細胞后，全部在36d前死于造血異常，此類小鼠若在第3，10，17d 注射100 μg 的抗CXCR4，則7/12的腫瘤可完全去除，5/12腫瘤負荷明顯降低，并且未觀察到毒性作用。若由此證實，抗CXCR4可抑制NHL細胞的跨血管遷移作用，影響其向骨髓遷移，并且促進NHL細胞凋亡、降低腫瘤負荷，提示CXCR4 抗體及干擾CXCR4 作用的分子在NHL治療中有一定的臨床意義。我們的研究結果表明，轉染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA的JURKAT細胞CXCR4基因表達明顯受抑制；與對照組比較，其細胞侵襲能力亦明顯降低。

總之，我們應用RNA干擾靶向沉默技術，高效特異性地抑制淋巴瘤細胞CXCR4 基因的表達，從而抑制腫瘤的侵襲能力。由此可見CXCR4在惡性淋巴瘤侵襲、轉移的分子機制中扮演重要角色，而靶向CXCR4基因治療則顯示出潛在的療效和前景。

參考文獻：

[1]Muller A， Homey B， Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature，2001，410：50-56.

[2]Trentin L， Cabrelle A， Facco M， et al . Homeostatic chemokines drive migration of malignant B cells in patients with non2Hodgkin lymphomas[J].Blood，2004，104 （2）：502-508.

[3]Bertolini F， Dell'Agnola C， Mancuso P， et al. CXCR4 Neutralization ， a novel therapeutic approach for non-hodgkin's lymphoma[J].Cancer Res，2002，62（11）：3106-3112.

[4]Reynolds A， Leake D， Boese Q， et al. Rational siRNA design for RNA interference [J]. Nat Biotechnol， 2004， 22（3）： 326-330.

[5]Aoki Y，Cioca DP， Oidaira H， et al. RNA interference may be more potent than antisense RNA in human cancer cell lines [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol， 2003， 30（1-2）：96-102.

編輯/申磊