重組人促卵泡激素促排卵藥效學研究

摘要：目的 通過觀察重組人促卵泡激素對正常大鼠超排卵作用及對不排卵模型大鼠的排卵影響，研究rhFSH對大鼠的藥效學作用。方法 ①超排卵實驗，正常雌性大鼠發情后期開始皮下注射rhFSH，給藥劑量15IU/kg/d，連續3d，發情前期給HCG10IU/只；②受孕實驗，給藥同上，發情前期給予HCG后將雌性大鼠與雄性大鼠合籠；③無排卵模型實驗，幼年雌性SD大鼠注射外源雄激素制造不排卵模型，用rhFSH治療15d。結果 rhFSH對正常大鼠的血清促性腺激素水平沒有明顯的抑制，rhFSH明顯增加正常大鼠的黃體數和卵泡數目和受孕大鼠的胎鼠數（與正常組相比，P<0.05）；可以改善無排卵模型大鼠的血清性激素水平，增加黃體數目和成熟卵泡（與模型組相比，P<0.05）。結論 rhFSH對正常大鼠超排卵和無排卵大鼠卵泡發育有較好的促進作用。

關鍵詞：排卵；大鼠；藥效學

重組人促卵泡激素（Recombinant human follicle-stimulating hormone， rhFSH）是將帶有重組后人促卵泡激素（hFSH）基因的質粒共轉染中國倉鼠卵巢細胞（CHO），經過培養表達生產的。它是目前人類輔助生殖技術中常用的藥物。由于糖基化作用的原因，原核表達系統難以生產出rhFSH。迄今為止，全球僅有兩家公司的rhFSH 藥物上市。對于動物的rhFSH藥效學研究沒有系統的報道，我們根據其臨床的主要適應癥設計了三個實驗對其藥效學作用進行系統的研究。對于超排卵作用方面，通過超排卵實驗和受孕實驗兩個實驗來進行研究，對于無排卵作用方面，通過rhFSH對雄激素致無排卵大鼠模型的作用實驗來進行研究。為重組人促卵泡激素的可靠藥效學評價建立基礎。

1材料與儀器

1.1實驗動物 雌性SD大鼠，體重200～250g；雄性SD大鼠，體重250～300g；9日齡雌性SD大鼠；均由中山大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為：SCXK（粵）2011-0029。

1.2藥物與試劑 重組人促卵泡激素（rhFSH， Gonal-FR），生產廠家：默克雪蘭諾有限公司，批號A0002920；0.9% 氯化鈉注射液（NS），廣東艾希德藥業有限公司生產，生產批號：121027207；HCG，杭州動物藥品廠， 批號12010；丙酸睪酮注射液，上海通用制藥有限公司，批號111104；甲醛，廣州化學試劑廠，生產批號：20120703，規格：AR，500ml/瓶；水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120111，規格：250g/瓶；FSH、E2、LH、P、T激素檢測化學發光試劑盒均為雅培貿易（上海）有限公司產品。

1.3主要儀器 光學顯微鏡成像系統：LEICA，DM5000B；全自動化學發光檢測系統，Abbott雅培公司，型號：ARCHITECT i2000 sr；電子天平：METTLER TOLEDO，SB32000。

2實驗方法

2.1促排卵實驗

2.1.1超排卵試驗 30只成年雌性SD大鼠按體重隨機分為空白對照組、rhFSH組每組15只，各組大鼠體重分布相似。通過陰道涂片法確定雌性大鼠的發情周期。發情周期為5d，分為發情間期（2d），發情前期，發情期和發情后期。從發情后期開始給藥，空白對照組皮下注射生理鹽水（NS）1ml/kg/d，給藥組皮下注射rhFSH 15IU/kg/d（根據臨床推薦劑體表面積折算成大鼠的劑量），1次/d，連續注射3d，第4d（發情前期）皮下注射HCG10IU/只（有類似黃體生成素的作用，與FSH合用，可誘發排卵），第5d（發情期）上午對大鼠進行10%水合氯醛腹腔麻醉，腹腔靜脈取血3ml，用于檢測生化指標。處死后摘除卵巢，稱重用Bouin氏液固定，常規脫水，包埋，石蠟切片，每隔6μm做連續切片，用于HE染色觀察卵巢組織形態學指標。

2.1.2受孕實驗 動物分組及給藥方法同\"2.1.1\"，并于第4d（發情前期）皮下注射HCG10IU/只后，將雌性大鼠與健康成年雄性大鼠1：1合籠，次日觀察交配數（以觀察到有精子或有陰道栓的為判斷標準），記錄交配數，已交配的繼續飼養12d后處死，分離子宮，記錄受孕數，計算受孕率；分離受孕大鼠子宮，記錄胚胎數，計算受孕胎鼠數。

2.2不排卵模型的治療作用

2.2.1造摸 參照魏美娟，俞瑾方法，9d齡，其中16只由頸背部一次性皮下注射中性茶油0.05ml為正常對照組；剩余35只由頸背部一次性皮下注射丙酸睪酮1.25mg/只，為造模動物組。第70d齡陰道開口，連續陰道涂片兩個動情周期。正常對照組動物連續陰道涂片應呈現典型動情周期（動情前期、動情期、動情后期、動情間期），將動情周期不典型者剔除；而造模動物組動物的陰道上皮細胞應無動情周期變化，呈持續性角化，提示無排卵大鼠模型制作成功，將未成功者剔除。經過兩個動情周觀察正常對照組有1只動情周期不典型剔除，造模動物成功率90.8%。

2.2.2給藥 第81d齡后，正常對照組大鼠15只，按1ml/kg/d皮下注射給予蒸餾水，將成功無排卵大鼠模型動物，按體重隨機分為2組模型對照組16只、rhFSH組16只，模型對照組大鼠按1ml/kg/d皮下注射給予生理鹽水；rhFSH組大鼠按15IU/kg/d給予rhFSH。給藥結束后，各組大鼠均連續陰道涂片兩個動情周期，以判斷大鼠排卵情況。

2.2.3取材 各組大鼠于動情周期前期時。再取子宮、卵巢、腎上腺、垂體、組織稱重，子宮、卵巢、腎上腺計算臟器指數，并均選取左側的卵巢和子宮組織標本置10%中性甲醛中固定，常規脫水，包埋，石蠟切片，每隔6μm做連續切片，用于HE染色觀察卵巢組織形態學指標。

3結果

3.1正常大鼠超排卵實驗結果

3.1.1血清性激素激素影響 結果由表1所示，rhFSH組與空白對照組相比，正常雌性大鼠發情期血清性激素（FSH、E2、P、LH）水平無統計學差異（P>0.05），提示在本研究劑量下rhFSH對正常大鼠發情期血清性激素水平沒有明顯的抑制作用。

3.1.2卵巢組織形態學 大體觀察可見兩組大鼠卵巢組織均色澤鮮紅邊緣光滑，卵泡細胞結構均較規則，與空白對照組相比，rhFSH組卵巢體積較空白對照組略大；光鏡下觀察rhFSH組卵泡顆粒細胞層數較空白對照組明顯增多；與空白對照組相比，rhFSH組大卵泡數目和小卵泡數目有顯著性增加差異（P<0.01），提示rhFSH對卵泡發育和超排卵有明顯促進作用，見表2。

3.1.3受孕胎鼠數影響 大體觀察，兩組大鼠胚胎發育程度都較均勻；與空白對照組相比，rhFSH組可明顯增加雌性受孕大鼠胚胎數（P<0.01），交配率及受孕率未見顯著差異（P>0.05），提示rhFSH可明顯促進卵泡的超排卵作用，見表3。

3.2 不排卵模型實驗結果

3.2.1血清性激素影響 與正常對照組比較，無排卵模型組大鼠各激素水平均顯著差異改變（P<0.01），FSH、E2、P、LH顯著降低，T顯著升高；與模型對照組比較，rhFSH組能顯著回升血清FSH、E2、P、LH，顯著降低血清T水平（P均<0.05或0.01），rhFSH對其它激素水平均有一定的改善作用，但未見統計學差異（P>0.05）。提示rhFSH對高雄激素導致的無排卵模型大鼠的生殖激素水平有一定的改善作用，見表4。

3.2.2 臟器指數 子宮指數、卵巢指數、腎上腺指數、垂體重量變化，與正常對照組相比，模型對照組的子宮體指數和卵巢體指數顯著降低（P<0.01），腎上腺指數和垂體重量無顯著差異，與模型組相比rhFSH組子宮指數和卵巢體指數有增加的趨勢無統計學意義（P>0.05）。腎上腺指數和垂體重量未見明顯差異（P>0.05），見表5。

3.2.3 卵巢病理形態學 大體觀察可見正常對照組卵巢體積較大色澤鮮紅，模型組卵巢萎縮色澤蒼白，rhFSH組卵巢體積較模型組大，可觀察到部分大鼠卵巢色澤呈粉紅色；光鏡下觀察正常組卵泡顆粒細胞排列整齊，層數較多有較多黃體組織，模型組卵泡顆粒細胞排列不規則，幾乎無黃體組織，rhFSH組卵泡顆粒細胞排列較整齊顆粒細胞層數較模型組增加，黃體組織較模型組增加；與正常對照組相比，模型組動物的次級卵泡、成熟卵泡和黃體數量明顯減少（P<0.05）；與模型組相比，rhFSH組動物次級卵泡、成熟卵泡和黃體數量相比模型對照組有明顯增加（P<0.05），提示：rhFSH對高雄激素致無排卵大鼠有一定的治療作用，見表6。

4討論

促性腺激素（gonadotropin，Gn） 藥物促排卵在不孕癥治療與人類輔助生殖技術實施中具有重要的地位。促性腺激素包括FSH、LH、HCG，FSH 及LH 是 主要參與卵泡生長發育的調控 ，特別是前者。目前含FSH的促性腺激素產品有HMG、uFSH、uFSH-HP 和rhFSH。而具有生物活性的FSH量明顯高于HMG， 可有效避免內源性LH 過高或LH 峰提早出現， 提供更完善的生殖生理環境， 有利于改善子宮內膜容受性、促進優勢卵泡發育， 獲得高質量成熟卵母細胞。基因重組技術使純化的FSH 用于臨床，克服了尿源性促性腺激素中大劑量LH 及其他雜質的干擾，同時因其藥物濃度的一致性，在體外受精聯合胚胎移植技術（IVF）促排卵周期中較尿源性促性腺激素能獲得足量優質卵子，臨床上重組FSH也適用于治療PCOS中克羅米芬無反應的患者。

本研究的超排卵實驗結果顯示rhFSH對正常大鼠的發情期血清性激素（FSH、E2、P、LH）水平影響沒有明顯影響，提示rhFSH對正常大鼠的促性腺激素分泌沒有明顯抑制；光學顯微鏡檢查結果，rhFSH組的大卵泡數目和小卵泡數目顯著增加；大鼠受孕實驗中rhFSH組受孕大鼠的胚胎數明顯增加。提示rhFSH對正常大鼠的超排卵作用。卵泡發育過程中， 卵泡刺激素（FSH）是重要的調控激素，通過外源性激素的注入，提高血液中激素濃度，降低發育卵泡的閉鎖，增加早期卵泡發育到成熟卵泡的數量，從而使雌性動物每次排卵數目增加。它在卵泡早中期給于超越竇卵泡所需求的閾值， 募集更多的卵泡達到多個卵泡發育的目的， 并可以刺激顆粒細胞的細胞色素P450 和芳香化酶的表達。雄激素彌散入顆粒細胞周圍， 并通過芳香化酶的作用轉化為雌激素， 足夠雌激素的產生對于成功受精和著床是必須的。黃體生成素（LH）主要作用于晚卵泡期，直接調控卵泡的成熟，促進雄激素的合成， 刺激卵泡膜的17-a 羥化酶的活性。卵巢顆粒細胞在卵泡中晚期才表達LH 受體， 此時與FSH 共同作用， 促進卵泡的發育。

本實驗進行的rhFSH對大鼠無排卵動物的促排作用研究，采用動物模型是雄激素致不孕大鼠（ASR）模型，該大鼠成年后表現為高雄激素、低促性腺激素、無排卵和多囊卵巢等此模型無排卵，卵巢多囊性改變與人PCOS相似外，血清激素水平也符合人PCOS。本研究結果顯示模型組血清性激素水平FSH、E2、P、LH顯著低于正常對照組，而睪酮水平明顯高于正常對照組，呈現高雄激素血癥狀，它是PCOS的重要特征之一；陰道涂片檢查顯示模型組無動情周期變化，提示無卵泡排出；光學顯微鏡下卵巢組織學檢查顯示模型組卵泡呈囊性擴張，少見卵母細胞與卵丘，幾乎無黃體，與文獻報道一致。與模型組相比，rhFSH組大鼠血清促卵泡激素、雌性激素水平有明顯的提高，子宮指數和卵巢指數均有增加的趨勢，次級卵泡、成熟卵泡和黃體數目均明顯增加，提示rhFSH對PCOS無排卵大鼠卵泡發育有一定的促進作用。

綜合以上，研究較為系統的評價了rhFSH對大鼠的促排卵作用，包括大鼠超排卵作用和對PCOS無排卵大鼠的促排卵作用，結果表明rhFSH對正常動物有明顯的促排卵作用，提高受孕率；對不排卵模型動物的卵泡發育也有明顯的促進作用。

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