綠膿菌素誘導分化的U937細胞氧化損傷及抗氧化劑對其保護作用的實驗研究

摘要：目的 探討綠膿菌素（ PCN ）誘導U937細胞氧化損傷及抗氧化劑（NAC和PDTC） 對其損傷的保護作用。方法 選擇不同濃度PCN （5， 25和50μM）感染佛波酯（PMA）分化的U937細胞24h，選擇最佳濃度PCN （25μM）進行感染實驗。給予不同濃度的 NAC（ 5， 10 or 20 mM）及PDTC （ 50、100、200μM） 預處理U937細胞1h ，PCN 感染細胞24h后，應用試劑盒進行丙二醛（ MDA ）、乳酸脫氫酶（ LDH）、超氧化物歧化酶 （SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性以及谷胱甘肽（GSH）含量測定。結果 與正常對照組相比，模型組LDH漏出量增加，MDA含量增加，SOD及CAT活性下降，GSH含量下降，呈劑量依賴關系。與模型組相比，NAC及PDTC干預組均呈LDH漏出量減少，MDA含量減少，SOD及CAT活性升高，GSH含量增加，呈濃度依賴關系，組間比較差異有統計學意義。結論 PCN可以誘導U937細胞氧化損傷，并呈劑量依賴關系， NAC及PDTC對PCN誘導J774細胞氧化損傷具有保護作用。

關鍵詞：綠膿菌素；氧化損傷； U937細胞； N-乙酰半胱氨酸； PDTC

綠膿菌素（pyocyanin，PCN）是銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）產生的一種藍色的有活性的氧化還原次級代謝產物，能自由地穿透生物膜、干擾正常離子轉運、打斷細胞呼吸鏈、過量產生氧自由基導致細胞死亡，PCN被認為是氧化還原的活性產物，是重要的致病因子和促炎介質。近年研究顯示[1]，PCN在A549人肺泡上皮細胞株和人支氣管上皮細胞，能鈍化過氧化氫酶，減少基因編碼的過氧化氫酶的轉錄，在肺上皮細胞和內皮細胞，PCN也可調整谷胱甘肽（GSH）氧化還原周期性變化[2，3] ，提示氧自由基和氧化還原反應在PCN介導的損傷中具有重要作用。

目前關于PA與抗氧化劑的研究較多，然而，關于PCN與單核巨噬細胞氧化損傷，以及抗氧化劑之間的研究報告較少。本研究選用佛波酯分化后的U937細胞作為巨噬細胞模型，研究綠膿菌素感染巨噬細胞導致氧化損傷，并探討抗氧化劑（包括NAC及PDTC）對巨噬細胞的保護作用，研究綠膿菌素感染宿主的發病機制，為今后PA感染的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 人白血病細胞株U937購自北京中科院細胞中心，用含10%小牛血清的RPMI 1640 培養基傳代培養。RPMI 1640 購自華美公司，小牛血清購自Gibco公司，綠膿菌素購自Sigma公司，NAC及PDTC購自大連寶生物公司，谷胱甘肽檢測試劑盒，南京建成生物工程公司，其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 細胞培養與分化 常規進行U937細胞傳代培養。取5-30代U937細胞（細胞濃度達1×109/L），應用PMA（10μg.L -1）誘導U937細胞分化，分化成熟后的U937細胞作為細胞模型用于以下實驗[4，5]。

1.3 綠膿菌素感染細胞試驗 將PMA分化的U937細胞洗滌后，將5、10、25μM綠膿菌素加入含U937細胞的培養基中，于37℃、5%CO2條件下孵育24h。收集培養上清，保存于-80℃冰箱中。

1.4 噻唑藍（MTT）毒性實驗 選擇570 nm作為測試波長，于酶聯免疫監測儀上檢測各孔光吸收值（A值）并記錄結果，應用MTT還原法進行檢測。以吸光值為縱坐標、時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。通過如下公式進行細胞生長抑制率計算：即細胞生長抑制率/% = 1 - 實驗組A值/對照組A值×100%。

1.5 LDH 活性及過氧化氫酶（CAT）活性檢測 分別取細胞上清液，根據試劑盒的要求測定LDH及CAT活性。

1.6 MDA含量測定及SOD活性檢測 分別取細胞上清液，根據試劑盒的要求測定MDA及SOD活性。

1.7 GSH含量測定 GSH含量的檢測：利用二硫代二硝基苯甲酸與還原型GSH上的巰基反應，對生成的黃色化合物進行比色定量，具體操作步驟按說明書進行。蛋白含量的測定采用Bradford法進行。

1.8 統計學方法 實驗數據采用SPSS18.0軟件進行分析，所有計量資料以（x±s）表示，計量資料用Compare Means中的One-way ANOVA，組間兩兩比較采用Dunnett- t檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 U937細胞的分化 U937細胞常規傳代培養為單個懸浮細胞。將U937細胞與10μg.L -1 PMA共培養8 h后，細胞形態開始發生改變：即由懸浮的、獨立的小圓形細胞轉變為貼壁的、成團的、不規則狀的細胞，狀似阿米巴形態；48 h后，約80%的細胞貼壁生長。

2.2 細胞毒性實驗 為評估PCN、NAC及PDTC對細胞活力的影響，選用PCN （5， 25和50 μM） 、NAC（ 5， 10，20 mM）、PDTC （ 50，100，200μM）與PMA分化的U937細胞分別共培養24 h，通過MTT法行毒性檢測。結果顯示，以上各種濃度對細胞活力均無影響，故選用以上相應濃度進行感染實驗。

2.3 PCN對PMA分化的U937細胞氧化指標的影響 選用不同濃度的PCN（5，25，50 μM）感染U937細胞24h，然后收集細胞上清，應用試劑盒分別檢測MDA含量、LDH漏出量、 CAT及SOD活性。實驗結果顯示：與對照組相比，模型組各組的MDA含量增加，LDH漏出量增加，CAT及SOD活性下降，且呈劑量依賴關系，組間比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。結果表明，PCN能誘導U937細胞氧化損傷。

2.4 NAC對PCN 感染PMA分化的U937細胞各氧化指標的影響 NAC（5， 10，20 mM）預處理PMA分化的U937細胞1h，選擇PCN（25μM）感染U937細胞，24h后收集細胞上清并檢測上述指標。實驗結果顯示：與模型組相比，不同濃度NAC干預組MDA含量減少，LDH 漏出量減少，CAT及SOD活性升高，且呈劑量依賴關系，組間比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2。實驗結果表明，NAC具有抗氧化損傷作用。

2.5 PDTC對PCN 感染PMA分化的U937細胞各氧化指標的影響 PDTC （ 50，100，200μM） 預處理PMA分化的U937細胞1h，PCN（25μM）感染細胞24h，收集上清并檢測上述指標。實驗結果顯示：與模型組比較，不同濃度PDTC干預組MDA含量減少，LDH 漏出量減少，CAT及SOD活性升高，且呈劑量依賴關系，組間比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2。實驗結果表明，PDTC具有抗氧化損傷作用。

2.6 PCN對PMA分化的U937細胞GSH含量的影響 研究表明，PCN直接氧化谷胱甘肽，降低其在氣道上皮細胞的水平[3]。本實驗選用不同濃度的PCN（5，25，50 μM）刺激PMA分化的U937細胞24h，然后收集細胞上清，應用GSH試劑盒測定其含量，觀察PCN作用于U937細胞后GSH含量的變化。結果顯示：與對照組相比，不同濃度模型組GSH含量減少，呈濃度依賴關系，組間比較差異有統計學意義（P< 0.05），見表1。

注：*P < 0.05， compared with control； **P < 0.01， compared with control.

2.7 NAC對PCN 感染PMA分化的U937細胞GSH含量的影響 NAC（5， 10，20 mM）預處理PMA分化的U937細胞1h，選擇PCN（25μM）感染U937細胞，24h后收集細胞上清并檢測GSH。實驗結果顯示：與模型組比較，不同濃度NAC干預組GSH含量增加且呈劑量依賴關系，組間比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

注：Notice：Control： Controlgroup； PCN2：PCN（25μM） ； NAC1（5 mM）； NAC2（10mM）； NAC3（20mM）；*P < 0.05， compared with control； **P < 0.01， compared with control； @P < 0.05， compared with PCN2 ； @@P < 0.01， compared with PCN2

2.8 PDTC對PCN 感染PMA分化的U937細胞GSH含量的影響 PDTC （ 50，100，200μM）分別預處理PMA分化的U937細胞1h，選擇PCN（25μM）感染U937細胞，24h后收集細胞上清并檢測GSH。實驗結果顯示：與模型組比較，不同濃度PDTC干預組GSH含量增加且呈劑量依賴關系，組間比較差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

注：Notice：Control：Controlgroup；PCN2：PCN（25μM） ； PDTC （ 50μM）；PDTC （ 100μM）；PDTC （ 200μM）. *P < 0.05， compared with control； **P< 0.01， compared with control. @P< 0.05， compared with PCN2 ； **P < 0.01， compared with PCN2

3 討論

通過PMA、維生素D3等作用后的U937細胞具有人單核/巨噬細胞功能，因此作為巨噬細胞模型廣泛用于實驗研究。作為重要的機體免疫防御細胞，巨噬細胞氧化損傷后，其吞噬能力下降，易受各種病原體感染，如細菌、病毒等。抗氧化酶能保護細胞免受氧化損傷，許多抗氧化酶在細胞受到氧化損傷時可維持細胞的基本功能，如在過氧化氫酶（CAT）及過氧化物酶（GPX）作用下可分解為水和氧，致使細胞無毒化。作為細胞內脂質過氧化終產物，MDA含量增多可增加細胞氧化損傷程度。

銅綠假單胞菌為重要院內感染致病菌，耐藥性高，感染機制復雜，治療棘手。體外研究發現，PA可分泌多種毒力因子如鞭毛蛋白、PCN、還原蛋白等，這些毒力因子可感染氣道上皮細胞分泌細胞因子，引起細胞損傷，并可導致嚴重的氧化損傷。研究還發現，PCN直接氧化谷胱甘肽，降低其在氣道上皮細胞的水平[3]。生理狀態下，細胞內的抗氧化系統維持在一定水平，以清除生理代謝過程中產生的自由基，避免其與蛋白、核酸等生物大分子反應而損傷細胞。如在外來刺激作用下，細胞可產生大量自由基，抗氧化系統被調動起來。GSH系水溶性小分子抗氧化劑，分為氧化型和還原型，在維持細胞內氧化還原穩態中有重要的作用，參與許多氧化物質如H2O2，ROOH等的解毒過程。而且由于其本身易受自由基氧化，從而保護體內更多蛋白質和酶等分子中的巰基不被氧化，保護正常組織細胞。本研究發現，PCN感染PMA分化的U937細胞后，導致LDH漏出量增加，MDA含量增加，SOD及CAT活性下降，GSH水平降低，上述各指標呈劑量依賴關系。實驗結果表明PCN可能誘導U937細胞氧化損傷，產生大量氧自由基，導致MDA含量增加，以及抗氧化酶類活性降低的氧化應激表現，與國內外文獻報道結果一致。

作為強有力的抗氧化劑，PDTC及NAC具有清除自由基功能。如NAC進入細胞后發生去乙酰化并生成半胱氨酸，可促進GSH合成，而GSH是細胞抗氧化應激損傷的主要力量。現有研究表明吸入谷胱甘肽（GSH）或其合成的前體NAC，可增加肺囊性纖維化患者降低的GSH 水平，并減輕PA 引起宿主的氧化損傷。PDTC不僅是公認的NF-KB抑制劑，也是一種抗氧化劑，可通過直接清除活性氧、增強內源性抗氧化酶活力，糾正PCN感染后氧化還原系統的失衡。本研究結果顯示：NAC及PDTC干預組均呈LDH漏出量減少，MDA含量減少，SOD及CAT活性升高，GSH含量增加，呈濃度依賴關系。實驗結果表明，補充外源性抗氧化劑后，有利于自由基的清除及機體氧化/抗氧化機制的平衡。NAC及PDTC對PCN誘導的U937細胞氧化損傷具有保護作用，二者可能通過抗氧化效應而發揮作用，但其具體機制還需進一步探討。

參考文獻：

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編輯/王海靜