mir—223—3p在急性心肌梗死患者血漿中的表達特征及臨床意義

摘要：目的 觀察急性心肌梗死患者血漿mir-223-3p的表達情況，分析血漿mir-223-3p用于急性心肌梗死（AcuteMyoeardialInfraetions，AMI）臨床診斷的可能性。方法 選擇AMI患者29例，陳舊性心肌梗死患者31例，健康志愿者10例，入院后1h、24h、2d、7d分別抽取肘靜脈血。real-timePCR檢測mir-223-3p表達水平，改良szasz法檢測CK-MB，免疫印記法檢測cTnI。結果 AMI患者血漿mir-223-3p表達水平較陳舊性心肌梗死患者及健康組均顯著升高（P<0.01），陳舊性心肌梗死患者與健康組之間比較無統計學差異（P>0.05）。AMI患者入院1h血漿mir-223-3p表達水平已達到峰值，24h后明顯降低，第2d基本進入平臺期，并持續至第7d，但仍明顯高于陳舊性心肌梗死患者與健康組入院時的水平（P<0.01）。mir-223-3p表達水平與cTnI和CK-MB均呈正相關，相關系數分別為（r=0.848，P=0.000）、（r=0.804，P=0.000）。結論 mir-223-3p在AMI早期表達水平明顯升高，而且擁有較cTnI和CK-MB更早的時間窗，提示mir-223-3p對AMI早期診斷具有一定價值。

關鍵詞：急性心肌梗死；mir-223-3p；CK-MB；cTnI

隨著現代社會生活方式及飲食結構的改變，急性心肌梗死（AcuteMyoeardialInfraetions，AMI）的發病率逐年增加，在我國已成為一種嚴重危害人民群眾健康的重要疾病。因此，對AMI的預防及治療成為當前一項重要課題。近年來發現的miRNA與多種疾病的發生發展有著極為密切的關系。最近研究表明，miRNA廣泛參與調控心血管系統的發育和疾病發生過程，并且具有較高的組織特異性，在外周血中可以穩定存在而不被分解，推測miRNA可能是一個理想的生物檢測標志物。

1資料與方法

1.1一般資料 取得患者知情同意后，收集山東中醫藥大學附屬醫院心病科2012年8月～2013年12月，29例AMI患者（參照2012年ESC/ACC/AHA/WHF工作聯盟發布修訂后的第3版心肌梗死全球統一定義）、31例陳舊性心肌梗死患者、10例老年健康體檢者。

1.2主要試劑和儀器 低溫高速離心機（美國ThermoScientific公司），熒光實時定量PCR儀7300型（美國Appliedbiosystems公司），Trizol（美國Invirotrogen公司），TIANScriptRTKIT反轉錄試劑盒（北京天根生化科技公司），SYBRPremixExTaqTMreal-time-PCR試劑盒（大連TaKaRa公司），引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。

1.3指標檢測

1.3.1標本采集 分別于入院后1h、24h、2d、7d經肘靜脈穿刺采集受試者外周血5ml，置于含EDTA的抗凝管中，靜置30min；室溫3000rpm離心15min，小心提取上清液分裝到去RNA酶的EP管中，置于-80℃低溫冰箱中保存待用。用于檢測cTnI、CK-MB的外周血與用于miRNA提取的外周血同時采集，置于內含促凝劑（惰性分離膠）的真空采血管（BD公司生產）內，及時送化驗室檢驗。

1.3.2real-timePCR檢測mir-223-3p 按照Trizol途徑提取總RNA，紫外測總RNA的純度及濃度。根據逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA；選用miR-93作為內參，逆轉錄引物序列如下：miR-223-3p：GSP：5'GGGGTGTCAGTTTGTCAAA3'，R：5'CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'；miR-93：GSP：5'GGCAAAGTGCTGTTCGTG3'R：5'CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'，注：GSP是對應miRNA的特異引物，R是與RT引物相匹配的引物。real-timePCR按照說明書進行操作；反應條件為：95℃，10min；40個PCR循環（95℃，10s；60℃，60s（收集熒光））。為了建立PCR產物的融解曲線，擴增反應結束后，按（95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s）；并從60℃緩慢加熱到99℃（儀器自動進行-RampRate為0.05℃/s）。獲得產物擴增曲線與融解曲線及CT值。

1.3.3檢測CK-MB、cTnI 應用改良szasz法檢測CK-MB，采用免疫印記法檢測cTnI。

1.4統計學分析 采用軟件SPSS17.0進行統計學分析，所有數據均以均數±標準差（Mean±SD）表示，計算各樣本的△Ct值（目的基因Ct值-內參基因Ct值），各樣本的相對定量為2-△Ct，mir-223-3p組間表達差異用2-△△Ct（△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組）表示，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，多組間比較用方差分析，以P<0.05表示具有顯著的統計學差異，P<0.01表示結果在統計學上具有極顯著的差異。相關性分析采用Pearson相關分析。

2結果

2.1一般資料分析 本次試驗納入AMI患者29例，男16例，女13例，平均年齡（59.21±7.39）歲，陳舊性心肌梗死患者31例，男17例，女14例，平均年齡（58.74±6.91）歲，健康志愿者10例，男5例，女5例，平均年齡（56.63±4.89）歲。各組之間在年齡及性別構成上無統計學差異（P>0.05），消除了年齡及性別因素對試驗結果的影響。為排除冠心病相關因素高血壓、糖尿病、吸煙、高脂血癥對mir-223-3p表達量的影響，分別對其進行統計學分析，結果各組之間mir-223-3p表達量無統計學差異（P>0.05）。說明mir-223-3p在外周血中的表達與冠心病危險因素無明顯相關性。

2.2入院后各組受試者血漿mir-223-3p水平比較 AMI患者、陳舊性心肌梗死患者和健康者三組血漿mir-223-3p表達量比較，AMI患者入院后1hmir-223-3p表達水平較陳舊性心肌梗死患者和健康者均明顯升高且有顯著統計學意義（P=0.000，P<0.01），陳舊性心肌梗死患者與健康組之間比較無統計學差異。各組mir-223-3p表達量（見表1）。

2.3AMI患者不同時間窗血漿mir-223-3p水平比較 AMI患者入院1h血漿mir-223-3p水平即達到峰值，入院24h開始降低，在第2d時下降趨勢趨于緩慢，基本進入平臺期，并持續到第7d。（見表2，圖1）。

圖1 AMI患者不同時間窗血漿mir-223-3pCt值

2.4 mir-223-3p與cTnI、CK-MB的相關性分析 動態監測AMI患者入院后1h、24h、2d、7dcTnI、CK-MB表達水平（見表3）。入院1h出現升高，24h達到峰值，第2d開始明顯下降，第7d時進一步降低，并接近正常水平。結果提示mir-223-3p與cTnI、CK-MB表達水平在AMI入院早期均迅速升高，但mir-223-3p表達水平升高具有更早的時間窗以及更早的達峰時間（見圖1～圖3）。AMI患者血漿mir-223-3p水平與cTnI、CK-MB水平的Pearson相關性分析結果顯示，mir-223-3p表達水平與cTnI和CK-MB均呈正相關，相關系數分別為（r=0.848，P=0.000）；（r=0.804，P=0.000）。（見圖4）。

圖2 動態監測cTnI表達水平變化

圖3動態監測CK-MB表達水平變化

3討論

近年來心血管疾病己經超過癌癥成為威脅人類健康最主要的疾病，心血管疾病死亡率達16.77%，僅次于惡性腫瘤及腦血管疾病[1]。因此AMI早期及時、準確的診斷，采取積極有效的治療措施保證心臟及時再灌注以減少死亡率及改善預后具有重要臨床意義[2]。目前用于AMI臨床診斷的血清生物標志物主要有CK-MB、肌紅蛋白、cTn等[3，4]，然而考慮到上訴標志物在敏感性及特異性上的缺陷，對高敏感性及高特異性生物標志物的探求仍然是目前研究的焦點。近年來新發現的miRNA與心血管疾病的發生發展有著極為密切的關系[5～9]，miRNA具有較高的組織特異性、在血液中具有較高穩定性，推測miRNA可能是一個理想的生物檢測標志物。

隨著檢測技術的不斷改進，越來越多的miRNA被發現。大量動物實驗發現，心肌梗死早期較正常組出現多種miRNA表達水平的異常，而且其表達水平具有明顯的時效性，如miR-499[10]在大鼠心肌梗死1～3h開始升高，12h內

達到高峰，24h開始減少。另外，對miRNA-1[11]、miRNA-208[12]、miRNA-133[13]的相關研究亦顯示miRNA有潛力作為心肌梗死標志物。并且隨著心肌損傷及心功能的衰減，miRNA的種類及數量同樣發生變化，這對于下一步研究相關miRNA的作用機制同樣具有指導意義。

本研究從己經由AMI動物模型證實的相關miRNA中篩選出mir-223-3p，通過抽取AMI、陳舊性心肌梗死及健康體檢者血漿中的mir-223-3p，經過逆轉錄及實時定量PCR檢測出mir-223-3p在不同受試者間的差異性表達，進一步分析其對AMI的診斷作用。AMI患者、陳舊性心肌梗死患者和健康者三組血漿mir-223-3p表達水平比較，AMI患者入院后1hmir-223-3p表達水平較陳舊性心肌梗死患者和健康者明顯升高且有統計學意義（P=0.001，P<0.01），陳舊性心肌梗死患者與健康組之間比較無統計學差異。mir-223-3p在AMI早期表達水平明顯升高，而且擁有較cTnI、CK-MB更早的時間窗，AMI患者血漿mir-223-3p水平與cTnI水平Pearson相關性分析結果顯示，mir-223-3p表達水平與cTnI和CK-MB均呈正相關，提示mir-223-3p對AMI早期診斷具有一定價值，不僅能夠幫助我們更及時的診斷AMI，而且能夠作為cTnI/T、CK-MB的輔助標記物，進一步提高AMI的確診率，從而為AMI的再灌注治療節約寶貴的時間。

雖然目前關于mir-223-3p的作用機制研究還沒有相關文獻報道，但這并不能否定它對AMI潛在的診斷價值，循環miRNA分子標志物將改變和補充傳統AMI實驗室診斷標準。盡管目前對循環miRNAs的研究眾多，循環miRNAs在心血管系統中的生物學行為仍然是一個新的研究領域，作為AMI的診斷生物標志物仍有諸多問題尚待解決，例如：相關研究均存在樣本量小，受試病種單一的缺陷，具體選擇哪一種循環miRNAs作為AMI生物標記物也并不十分明朗，檢測技術的操作過程相對復雜等。但是，循環miRNAs的發現為AMI的診斷和治療提供了新的思路和方法，我們相信miRNA作為生物標志物是一個很有前途的研究領域，隨著技術的進步和應用，這個時代一定會提前到來。

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編輯/許言