人為操作因素對酶聯免疫吸附法檢測乙肝病毒血清標志物影響的探討

摘要：目的 ELISA技術在臨床實驗室的應用日漸廣泛，成為快速診斷和確診臨床疾病的一項免疫診斷技術。但是，到目前為止國家相關部門尚未出臺相應的實驗條件要求、人員培訓以及標準的操作流程，同時該技術實驗操作和結果判斷等環節較多，對臨床結果影響較大，鑒于此，我們就目前臨床實驗中需要關注的地方進行闡述，以便更好地改進規范性實驗技術步驟，有效減少臨床檢驗的誤診。方法 用試劑盒中抗-HBc，抗-HBe陰性對照標本按照操作說明書加樣后，分別于0，5，10，15，20，30min后加入酶標記物。結果 不同加酶時間可出現程度不同的假陽性，間隔時間越長，標本的假陽性越多。結論 不同加酶時間可出現程度不等的抗-HBc，抗-HBe抗體假陽性。為避免這種假陽性結果導致的差錯，建議嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

關鍵詞：假陽性；抗-HBc，抗-HBe；酶聯免疫吸附試驗

乙型肝炎病毒（HBV）血清標志物的5項指標檢測方法較多，但是目前臨床應用最多的還是酶聯免疫吸附試驗（ELISA），其中抗-HBc，抗-HBe采用競爭抑制法。

1 資料與方法

1.1試劑與材料

1.1.1質控品 購于貴州省臨檢中心質控品：20130111W，20130108W。

1.1.2試劑 均由珠海麗珠試劑股份有限公司提供。

1.1.3儀器 北京天石SM-3酶標儀；北京天石ZMX 988 B洗板機；上海醫療器械七廠HH.W21.Cu600型水浴箱。

1.1.4樣本 血液樣本來自本單位住院、門診患者，真空抽血5ml，分離血清待檢，共235份；用試劑盒中抗-HBc，抗-HBe陰性對照標本。

1.2操作方法

1.2.1.1將235份血清用生理鹽水按1：30稀釋，加入標本后立即加入酶結合物（使標本于酶結合物同步加入），37℃水浴30min，洗板，加入顯色劑，加入終止液，酶標儀比色，213份為陰性（標本A450nm>2.0為162份，標本A450nm>臨界值至2.0為51份）。

1.2.1.2將213份陰性血清用生理鹽水按1：30稀釋，另準備試劑盒中抗-HBc，抗-HBe陰性、陽性對照標本，平行做60孔，10孔一組分為A、B、C、D、E、F組，A組加入抗-HBc，抗-HBe陰性對照及標本后立即（0分鐘）加入酶結合物，以此類推于5（B組），10（C組），15（D組）20（E組），30（F組）分鐘加入酶結合物完成其他標本、陽性、陰性對照、及質控品，其他操作按標準操作說明書進行，分別獲得各自情況下的比色結果。臨介值（C.O）=陰性對照平均A值×0.5。

1.3統計學方法 采用F檢驗，樣品率采用x2檢驗，統計采用Excel軟件。

2 結果

2.1抗-HBc，抗-HBe抗體檢測間隔加酶結合物時間對結果的影響 見表1、表2。從表1可見，加入標本后5min，再加入酶結合物，即有24份A450nm值>臨界值0.1～0.35的標本出現假陽性，表現為測定標本A450nm值明顯下降至<臨界值0.7以內。隨著加樣后室溫放置時間的延長，假陽性明顯增多。放置時間≥20min時，假陽性顯著增加，約達到放置時間5min組的5倍，加樣后室溫放置30min，本試驗組的213份陰性標本僅剩96份仍為陰性結果。

從表2可見，加入標本后5分鐘，再加入酶結合物，即有14份A450nm值>臨界值0.1～0.35的標本出現假陽性，表現為測定標本A450nm值明顯下降至<臨界值0.7以內。隨著加樣后室溫放置時間的延長，假陽性明顯增多。放置時間≥20min時，假陽性顯著增加，約達到放置時間5min組的5倍，加樣后室溫放置30min，本試驗組的213份陰性標本僅剩110份仍為陰性結果。

3 討論

乙型肝炎病毒（HBV）屬嗜肝（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環狀DNA。乙型肝炎是危害嚴重的病毒性傳染病，廣泛流行于全世界，迄今為止，尚未發現無HBsAg陽性攜帶者地區。我國的乙肝病毒感染率約60%～70%；乙肝表面抗原攜帶率約占總人口的7.18%，以此計算，全國約1億人攜帶乙肝病毒，其中乙肝患者約3000萬。ELISA檢測抗-HBc，抗-HBe抗體的原理是采用基因工程重組表達的HBcAg、HBeAg包被固相反應板，加入標本的同時加入酶結合物，使待測標本中的HBcAb、HBeAb與酶結合物中的HBcAb、HBeAb公平競爭結合固相反應板上的HBcAg、HBeAg，形成\"抗體-抗原-抗體\"結構的免疫復合物。

臨床上檢測乙肝兩對半均采用手工加樣，日常工作中是存在標本加樣越多，加樣時間越長，加酶時間月晚，這樣勢必存在著先加入的血清較長時間與固相上的HBcAg、HBeAg結合，與酶結合物形成明顯的時間差，造成假陽性；其二，由于在制備工藝上存在至今尚未解決的問題，使純度受到影響，尤其是存在交叉反應、干擾物質的標本，在延時加入酶結合物情形，造成非特異性干擾，使假陽性增多。

加樣后多長時間再加入酶結合物就可出現假陽性？假陽性率多少？本次試驗證實，加樣后室溫放置5min，再加入酶結合物，就可出現7%～11%假陽性；加樣后室溫放置30min，再加入酶結合物，可出現48%～55%假陽性。一個熟練的檢驗工作者進行150個標本的稀釋和加樣約需26min，如果采用加完150個標本再加酶結合物的加樣方式，造成假陽性結果難以避免。我們建議： 采用加入血清后立即加入酶結合物，然后再加下一個血清的加樣方式，不要使用把每批次血清加完再加入酶結合物的加樣方式。 檢驗結果在臨界值范圍A450nm值<0.3的標本必須進行復檢。 陽性標本用金標復檢，避免標本加錯。④對兩對半少見模式嚴格復檢。

參考文獻：

[1]譚凌卉.ELISA法檢測HBV血清標志物影響因素的分析[J].湖南師范大學學報（醫學版），2009，6（2）：20.

[2]楊一鳴，等.化學發光免疫分析在HBVM定量檢測的臨床應用[J].放射免疫學雜志，2005，18：71-73.

[3]張國元，等.乙肝兩對半定量，乙肝DNA定量與乙肝前S1抗原94例的聯合檢測及意義[J].四川醫學，2005，26：571-572.

[4]宋炳榮，等.ELISA一步法檢測乙型肝炎病毒標志物影響因素的實驗研究[J].實用醫技雜志，2004，9（11）：65.

[5]吳大富，等.血細胞及溶血對EIA一步檢測乙型肝炎兩對半的影響[J].實用醫學進修雜志，2002，30（2）：122.

[6]李天星.現代臨床免疫學檢驗[M].北京：軍事醫學科學出版社，2001：57.

[7]陳仁杰.金標記免疫層析法檢測HBsAg的假陽性分析[J].臨床檢驗雜志，2007，（2）：160.

[8]席加秋，王中琳.金標記免疫層析法聯合ELISA法在檢測HBsAg中的應用[J].中國誤診學雜志，2008，（10）：2358.編輯/許言