海頭紅乙醇提取物的化學(xué)成分分析

林勇等

摘 要：研究紅藻海頭紅（Plocamium telfairiae Harv.）的化學(xué)成分，分析其抗菌活性來源。通過硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜和薄層色譜對海頭紅乙醇提取物的抗菌成分進行活性追蹤分離，并通過質(zhì)譜和波普數(shù)據(jù)分析鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。在分離過程中得到4種化合物，通過GC-MS、1H-NMR和13C-NMR對化合物進行分析鑒定，經(jīng)鑒定4種化合物分別為十六烷酸、十八烷酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸二辛脂，對羥基苯甲酸為海頭紅乙醇提取物中的一種抗菌化合物。

關(guān)鍵詞：海頭紅；乙醇提取物；化學(xué)成分

中圖分類號：R284.2 文獻標志碼：A 論文編號：2013-0599

Abstract： To study the chemical constituents and antimicrobial compounds of Plocamium telfairiae Harv.， the silica gel column， SephadexLH-20 column and thin layer chromatographic techniques were applied to separate and purify the compounds. structures of compounds were confirmed by the data of mass spectrum and spectral. Four compounds were isolated from the ethanol extract of Plocamium telfairiae Harv.. Then these compounds were identified by GC-MS， 1H-NMR and 13C-NMR spectral analysis. Four compounds were identified as n-hexadecanoic acid， octadecanoic acid， 4-hydroxybenzoic acid， dioctyl phthalate. The 4-hydroxybenzoic acid was an antimicrobial compounds from ethanol extract of Plocamium telfairiae Harv..

Key words： Plocamium telfairiae Harv.； Ethanol Extract； Chemical Compounds

0 引言

海頭紅（Plocamium telfairiae Harv.）為紅藻門杉藻目海頭紅科海頭紅屬海藻，生長在低潮帶巖灘上，主要分布于太平洋西海岸。國內(nèi)外對海頭紅屬的多種海藻的化學(xué)成分進行了研究，結(jié)果表明海頭紅屬的許多海藻含有多種鹵代單萜[1-3]。但關(guān)于海頭紅屬中的海頭紅種的化學(xué)成分研究的報道較少見，僅國內(nèi)少數(shù)學(xué)者對其進行了研究。苑輝卿等對青島沿海的海頭紅的成分進行了分析，鑒定了三十四烷、四十三烷、β-谷甾醇、對羥基苯甲醛、尿嘧啶等10個化合物[4-5]，張翼等人對海頭紅抗腫瘤成分進行了研究，報道了膽甾醇、3-β-乙酰氧基膽甾-5-烯-7-酮、膽甾醇-十八烷酸酯等6個化合物[6]。課題組前期對海頭紅提取物的抗菌活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)海頭紅的乙醇提取物對食用菌生產(chǎn)中的競爭性雜菌具有較好的抑制活性[7]，但是對其具體抗菌活性的來源還不清楚，而且有關(guān)海頭紅中抗菌化學(xué)成分的研究目前還處于空白的狀態(tài)。因此，筆者嘗試對海頭紅乙醇提取物中的抗菌成分進行進一步的追蹤分離，通過分離出其中的主要抗菌成分，繼而明確其抗菌活性的來源，從而為相關(guān)抑菌機理的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 提取材料 海頭紅采集于福建石獅市永寧鎮(zhèn)海岸巖灘，采回后用清水洗去藻體表面雜質(zhì)，再次用蒸餾水洗凈，然后放置于室內(nèi)陰干備用。

1.1.2 試劑 Sephadex LH-20（Pharmacia公司）；柱層析用200-300目硅膠（國藥試劑集團有限公司）；GF254薄層層析硅膠板（青島海洋化工廠）；其他常規(guī)藥品、試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 安捷倫6890/5973n色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（英國安捷倫公司）；AVANCE III 500核磁共振儀（瑞士Bruker）。

1.2 試驗方法

1.2.1 海頭紅提取物的制備 將已經(jīng)陰干的海頭紅，于45℃下烘干24 h后用高速萬能粉碎機粉碎成粉末。取海頭紅藻粉2.5 kg，用3倍體積量的95%乙醇浸提2次，每次浸提3天。將提取液過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后析出大量無機鹽，過濾取濾液繼續(xù)濃縮得到黑褐色浸膏60.25 g，占藻粉總重的2.4%。

1.2.2 海頭紅提取物的分離 將海頭紅提取物浸膏以70%甲醇溶解分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，石油醚萃取完后先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸掉甲醇，再用氯仿和乙酸乙酯進行萃取，每種溶劑萃取3次。將萃取收集的各部分溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得各萃取部分，分別得到石油醚萃取部分25.8 g（1.7%）、氯仿萃取部分17.5 g（0.7%）、乙酸乙酯萃取部分9.1 g（0.36%）。

石油醚萃取部分通過硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯[（20～1）：1]梯度洗脫，最后以乙酸乙酯清柱，獲得PE1-PE11共11個級分，PE2級份以正己烷：二氯甲烷：甲醇=3：3：1為洗脫劑在SephadexLH-20凝膠柱上進一步純化得到白色鱗狀化合物1約200 mg。

氯仿萃取部分部分進行減壓硅膠柱層析，200～300目硅膠，干法上樣，氯仿萃取相以石油醚-丙酮[（20：1）～（1：10）]進行梯度洗脫，以丙酮清柱，獲得PeA1～PeA13共13個級份。PeA1-PeA2級分以正己烷：二氯甲烷：甲醇=3：3：1為洗脫劑在SephadexLH-20層析柱上進一步純化得到白色粉末狀化合物2約10 mg；PeA5-PeA7級分繼續(xù)通過硅減壓膠柱層析以氯仿-甲醇[（15～5）：1]梯度洗脫，獲得PeAL1～PeAL24共24個流份，通過GF254硅膠板薄層層析檢測合并相同部分，PeAL3～PeAL4級分得到油狀化合物4約80 mg。

乙酸乙酯萃取部分通過硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯（5：1～1：5）進行梯度洗脫，以乙酸乙酯清柱，獲得PeE1～PeE11共11個級分；PeE2～PeE6部分繼續(xù)通過硅膠層析以氯仿-甲醇[（15～3）：1]進行梯度洗脫，得到PeEC1～PeEC32共32個級份，PeEC5～PeEC7得到有抗菌活性的油狀部分D，PeEC9～PeEC12級分上Sephadex LH-20層析柱進一步純化，以氯仿：甲醇=1：1洗脫得到12個流動分，其中級份3～4通過丙酮反復(fù)重結(jié)晶得到針狀結(jié)晶化合物3約15 mg。

1.2.3 海頭紅化學(xué)成分的儀器分析 GC-MS儀系安捷倫6890/5973n色質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱DB-5ms毛細管柱。氣相色譜條件：進樣口溫度：250℃；分流比50：1；升溫程序：100℃（5 min）→5℃/min→280℃（5 min）質(zhì)譜條件：離子源EI；電離電壓70 eV；掃描范圍：50～ 500 amu。核磁共振波普分析采用Bruker的AVANCE III 500型核磁共振儀，頻率500 MHz，位移值（δ）用ppm表示，以TMS作為內(nèi)標，偶合常數(shù)（J）用Hz表示。

2 分析鑒定

2.1 化合物1

白色細鱗片狀粉末，1H-NMR（CDCl3， 500 MHz）δ： 0.88（3H， t， J=6.5 Hz），1.22（24H， m），1.50（2H， m）， 2.28 （2H， t， J=7.0 Hz）； 13C-NMR（CDCl3， 125 MHz）δ： 180.34， 34.18， 31.82， 29.57， 29.39， 29.34， 29.26， 29.08， 27.35， 24.70， 22.70， 14.05； GC-MS： Tr=9.96 min， Area=100%， Qual=98 （n-hexadecanoic acid）； EI-MS m/z： 256[M]+， 241， 239， 227。通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索以及與相關(guān)文獻的核磁數(shù)據(jù)對比[8]，該化合物數(shù)據(jù)與十六烷酸信息一致，故確定化合物1為十六烷酸。

2.2 化合物2

白色粉末，1H-NMR（CDCl3， 500 MHz）δ： 0.88（3H， t， J=6.5 Hz）， 1.26（28H， m）， 1.58（2H， m）， 2.30（2H， t， J=7.5 Hz）； 13C-NMR（CDCl3， 125 MHz）δ： 180.21， 34.08， 31.90， 29.75， 29.66， 29.64， 29.59， 29.45， 29.38， 29.26， 24.70， 22.70， 14.08； GC-MS： Tr=12.82 min，Area=98%，Qual=99 （Octadecanoic acid）； EI-MS m/z ： 284[M]+， 256， 241， 213， 199。通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索以及于相關(guān)文獻的核磁數(shù)據(jù)對比[9]，該化合物數(shù)據(jù)與十八烷酸信息一致，故確定化合物2為十八烷酸。

2.3 化合物3

白色針狀結(jié)晶，1H-NMR（CD3COCD3， 500 MHz）δ： 6.93（2H， d， J=8.5 Hz）， 7.93（2H， d， J=8.5 Hz）； 13C-NMR（CD3COCD3， 125 MHz）δ： 115.73， 122.49， 132.51， 162.38， 167.16； GC-MS： Tr=4.1 min， Area=95%， Qual=59 （Benzoic acid， 4-methoxy-） ； EI-MS m/z：138[M]+， 121， 93。將核磁數(shù)據(jù)和質(zhì)譜信息與相關(guān)文獻的對比，該化合物數(shù)據(jù)與對苯羥基苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致[10-11]，故確定化合物3為對羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）。

2.4 化合物4

淡黃色油狀液體，1H-NMR（CDCl3， 500 MHz）δ： 0.93（12H， m）， 1.42（16H， m）， 1.61（2H， m）， 4.12（4H， dd， J=11.0 Hz， 5.2 Hz）， 7.52（2H， dd， J=6.0 Hz， 3.0 Hz）， 7.69（2H， dd， J=6.0 Hz， 3.0 Hz）； 13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ： 167.18， 132.58， 130.9， 128.64， 68.0， 38.67， 30.16， 28.62， 24.04， 22.96， 14.42， 10.65； GC-MS： Tr=19.2 min， Area=93%， Qual=90 （1，2-Benzenedicarboxylic acid， Bis（2-ethylhexyl） ester）； EI-MS m/z： 279， 251， 167， 149。通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索以及于相關(guān)文獻的核磁數(shù)據(jù)對比[12-13]，該化合物數(shù)據(jù)與鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯信息一致，故確定化合物為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯，又名鄰苯二甲酸二辛脂。

3 討論

筆者首次對海頭紅乙醇提取物中的抗菌成分進行了追蹤分離，并對追蹤分離過程中獲得的幾種化合物并進行了分析鑒定。在研究過程中，從乙酸乙酯萃取相中分離到了具有抗菌活性的油狀級分D和對羥基苯甲酸。通過對D級分進行GC-MS分析發(fā)現(xiàn)其中的抗菌成分為對羥基苯甲醛，但由于D級分樣品數(shù)量有限，筆者未對D級分進行進一步的分離，苑輝卿等[5]在對海頭紅化學(xué)成分研究過程中分離也到了對羥基苯甲醛。另外一個抑菌成分對羥基苯甲酸與對羥基苯甲醛是類似物，其可由對羥基苯甲醛氧化產(chǎn)生。由此可見，海頭紅藻體內(nèi)這些酚類物質(zhì)的含量是較高的，其有可能是海頭紅乙醇提取物抗菌活性的主要來源。

對羥基苯甲酸的脂類衍生物又稱為尼泊金脂，是一類低毒、高效、用量少、抑菌譜和pH適用范圍廣的優(yōu)良抗菌防腐劑[14]，其中的對羥基苯甲酸甲酯及其鈉鹽和對羥基苯甲酸乙酯及其鈉鹽在GB2760中列為可在直接攝入食品中應(yīng)用的防腐劑[15]。目前的研究表明，對羥基苯甲酸脂類的抑菌力和抑菌譜特性可以由其碳鏈長度進行調(diào)整[14]，同時有些對羥基苯甲酸脂類例如對羥基苯甲酸殼聚糖脂還具有較好的高溫穩(wěn)定性[16]，因而其對食用菌栽培料中雜菌的防治具有一定的應(yīng)用前景。目前為止，未見有對羥基苯甲酸脂類在該領(lǐng)域應(yīng)用的研究報道，有待進一步開展相關(guān)復(fù)配抗菌劑的研究。

筆者在海頭紅乙醇提取物的抗菌成分的活性追蹤過程中，對一些抗菌級分的抑菌活性進行了檢測，相關(guān)內(nèi)容另文報道。在對天然抗菌成分的分離鑒定研究中，分離物的活性的檢測是必不可少的環(huán)節(jié)，天然產(chǎn)物中活性成分的含量一般比較低，而傳統(tǒng)檢測方法大多需消耗較多樣品，這就導(dǎo)致在追蹤分離過程中常常發(fā)生未分到目標化合物樣品就已消耗殆盡的情況。筆者在研究過程中也犯了同樣的錯誤，導(dǎo)致許多活性級分的丟失，僅少數(shù)含量較高的成分能完成純化鑒定。因而，為了提高活性成分追蹤分離的效率和全面性，有必要改進活性跟蹤的檢測方法，采用諸如TLC-生物自顯影技術(shù)[17]、酶標儀濁度法[18]等新型的微量檢測手段，對海頭紅乙醇提取物再進行系統(tǒng)性的分離、分析。

試驗過程中還從海頭紅的乙醇提取物中分離到了鄰苯二甲酸二辛酯，鄰苯二甲酸二辛酯目前多用作塑料增塑劑，在各種醫(yī)療用品中廣泛使用。因而，其有可能源自試驗操作過程中的容器污染。張翼等[19]對海頭紅的脂溶性成分的研究中也發(fā)現(xiàn)了鄰苯二甲酸二辛脂和其他鄰苯二甲酸脂類，它們的含量在檢測樣品中達到了50.42%，含量之高遠超出外源污染合理值，因而推測鄰苯二甲酸脂類亦有可能是海頭紅本身的次生代謝產(chǎn)物，有待進一步研究確認。

參考文獻

[1] Díaz-Marrero A R， Rovirosa J， Darias J， et al. Plocamenols A-C. novel linear polyhalohydroxylated monoterpenes from Plocamium cartilagineum[J]. Journal of Natural Products，2002，65：585-588.

[2] Jongaramruong J， Blackman A J. Polyhalogenated monoterpenes from a Tasmanian collection of the red seaweed Plocamium cartilagineum[J]. Journal of Natural Products，2000，63：272-275.

[3] Rezanka Tomas， Dembitsky Valery M. Polyhalogenated homosesquiterpenic fatty acids from Plocamium cartilagineum[J]. Phytochemistry，2001，57：607-611.

[4] 苑輝卿，時巖鵬，曲顯俊，等.紅藻海頭紅藥效學(xué)及化學(xué)成分的研究I[J].中國海洋藥物，2000，19（5）：7-11.

[5] 苑輝卿，閻明濤，韋興光，等.紅藻海頭紅化學(xué)成分的研究Ⅱ[J].中國藥學(xué)雜志，2001，36（12）：806-808.

[6] 張翼.海藻抑制乙酰膽堿酯酶活性及紅藻海頭紅化學(xué)成分的研究[D].青島：中國科學(xué)院海洋研究所，2004.

[7] 歐陽桐嬌，鄭怡，劉艷如，等.海頭紅提取物抑制食用菌競爭性雜菌的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，19（19）：105-107

[8] Anwer M Suhail， Mohtasheem M， Azhar Iqbal， et al. Chemical Constituents from Melilotus officinalis[J]. Journal of Basic and Applied Sciences，2008，4（2）：89-94.

[9] 姜北，趙勤實，林中文，等.三花槍刀藥化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1996，13（6）：12-15.

[10] Muhammad S A， Muhammad S， Farzana A. Three p-cymene derivatives from Zataria multiora[J]. Phytochemistry，1999，52：685.

[11] Giang P M， Son P T， Matsunami K， et al. New megastigmane glucosides from Excoecaria cochinchinensis Lour. var. cochinchinensis[J]. Chem Pharm Bull，2005，12：1600-1603.

[12] 唐麗，李國玉，楊柄友，等.廣棗化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2009，40（4）：541-543.

[13] Lu X H， Zhang J J， Liang H. Chemical constituents of Angelica sinensis[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2004，13（1）：1-3.

[14] 楊壽清，鮑福根.對羥基苯甲酸酯衍生物的使用安全性和復(fù)配效果[J].冷飲與速凍食品工業(yè)，2003，9（4）：26-29.

[15] 中國國家標準化管理委員會.GB 2760—2007食品添加劑使用衛(wèi)生標準[S].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2008.

[16] 趙希榮，夏文水.對羥基苯甲酸殼聚糖酯的抑菌活性研究[J].食品科學(xué)，2007，28（2）：78-83.

[17] 曲建博，姿紅祥，范培紅.TLC生物自顯影技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用[J].中草藥，2005，36（1）：132-137.

[18] 宮霞，樂國偉，李云飛.家蠅幼蟲抗菌肽的抗菌譜及其與抗生素的協(xié)同作用[J].研究微生物學(xué)報，2005，45（4）：516-520.

[19] 張翼，陳昌祥，李曉明，等.紅藻海頭紅脂溶性成分研究[J].中草藥，2006，37（11）：1626-1627.