人工低溫脅迫下西洋杜鵑生理生化指標(biāo)的變化

余麗玲等

摘 要：為了解西洋杜鵑的抗寒機(jī)制，以西洋杜鵑‘粉紅品種為實(shí)驗(yàn)材料，研究低溫脅迫條件下‘粉紅葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、CAT活性、POD活性等生理指標(biāo)的變化情況。從圖表可以看出：隨著脅迫時(shí)間的延長，脯氨酸含量變化不明顯，基本維持在正常水平；相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量較正常水平有緩慢上升趨勢(shì)；可溶性糖含量、可溶性蛋白含量，SOD活性、CAT活性、POD活性總體呈持續(xù)上升的變化規(guī)律；脅迫溫度越低，相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、CAT活性、POD活性越高，溫度低于3℃，即對(duì)‘粉紅產(chǎn)生較嚴(yán)重傷害，且溫度越低，傷害程度越嚴(yán)重，經(jīng)過0℃低溫脅迫4天，可大大提高‘粉紅的抗寒性。

關(guān)鍵詞：西洋杜鵑；人工低溫；抗寒性；生理生化指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S685.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號(hào)：2013-0659

Abstract： In order to understand the physiological mechanism of cold tolerance on Rhododendron hybridum， taking the variety of ‘Fenhong as materials to study the relative electric conductivity， MDA content， soluble sugar content， proline content， soluble protein content， SOD activity， CAT activity， POD activity and other physiological indexes under low temperature stress condition. From the chart we can know that with the stress time prolonged， the proline content kept steady， relative electric conductivity and MDA content increased gradually， soluble sugar content， soluble protein content， SOD activity， CAT activity and POD activity kept rising. The lower the temperature was， the higher the relative electric conductivity， MDA content， soluble sugar content， proline content， soluble protein content， SOD activity， CAT activity and POD activity would be. When the temperature was below 3℃， ‘Fenhong suffered serious damage， the lower the temperature was， the more serious degree of damage， after four days low temperature stress under 0℃， the cold acclimation of ‘Fenhong was greatly improved.

Key words： Rhododendron hybridum； Artificial Low Temperature； Cold Resistance； Physiological and Biochemical Indexes

0 引言

西洋杜鵑（Rhododendron hybridum）又名比利時(shí)杜鵑，為杜鵑花科杜鵑花屬植物，株形矮壯，花色和花型變化大，色彩豐富，系由皋月杜鵑、映山紅及毛白杜鵑等反復(fù)雜交而成[1]，是杜鵑花中最美的一類。低溫脅迫是植物栽培中常常遇到的一種災(zāi)害，低溫影響植物生長代謝和地理分布，會(huì)給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失，西洋杜鵑冬季在福建北部及特殊地區(qū)，如山區(qū)常會(huì)遭遇寒害甚至凍害，嚴(yán)重影響西洋杜鵑的生產(chǎn)及觀賞價(jià)值，因此研究西洋杜鵑的抗寒機(jī)制對(duì)西洋杜鵑的栽植養(yǎng)護(hù)具有實(shí)際性的指導(dǎo)意義。當(dāng)前對(duì)茶樹、番茄等植物的抗寒性研究較多[2-5]，對(duì)西洋杜鵑的研究主要集中在栽培、新品種選育等方面。本研究旨在通過對(duì)經(jīng)過低溫脅迫后的西洋杜鵑粉紅品種葉片相關(guān)抗寒性生理生化指標(biāo)的測(cè)定，系統(tǒng)評(píng)價(jià)西洋杜鵑的抗寒性以了解西洋杜鵑的抗寒機(jī)制，為西洋杜鵑抗寒性品種選育提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 供試材料

高25～35 cm，冠幅20～25 cm，生長健壯、長勢(shì)一致的一年半生無性系優(yōu)良盆栽苗‘粉紅品種。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

本次低溫脅迫實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)0、3、5、10、25℃5個(gè)處理溫度，其中25℃為對(duì)照溫度。低溫脅迫前把挑選好的西洋杜鵑幼苗先放入25℃人工氣候箱培養(yǎng)3天，再分別放入設(shè)有不同溫度的人工氣候箱，空氣相對(duì)濕度70%～80%，每天光照12 h，光照強(qiáng)度約為2000 lx，連續(xù)培養(yǎng)4天，每個(gè)氣候箱放置10盆，在培養(yǎng)期間不追施肥料，適時(shí)補(bǔ)充水分，保持土壤濕潤。于低溫脅迫的第2天、第3天、第4天、第5天的早晨采樣，每個(gè)處理溫度采取2～3 g去除主脈生長健康無病害的葉片，當(dāng)天立即稱取0.3 g葉片測(cè)定電導(dǎo)率，剩余葉片超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抗寒性生理生化指標(biāo)測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定采用電導(dǎo)儀法[6]；MDA和可溶性糖測(cè)定分別采用硫代巴比法、蒽酮比色法[7-8]；游離脯氨酸測(cè)定采用磺基水楊酸法[9-10]；可溶性蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[11]；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定采用NBT光化還原法[12]；過氧化物酶（POD）活力測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[13]；過氧化氫酶（CAT）測(cè)定采用紫外吸收法[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理采用Excel 2003和DPS軟件，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 西洋杜鵑葉片各生理生化指標(biāo)的低溫響應(yīng)

2.1.1 相對(duì)電導(dǎo)率的變化 對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定是衡量植物細(xì)胞膜破壞程度最簡單和最直接的方法，用電導(dǎo)儀測(cè)定胞質(zhì)電導(dǎo)率增加值可以迅速得知細(xì)胞膜破壞的程度[14]，即相對(duì)電導(dǎo)率的值與植物抗寒能力呈負(fù)相關(guān)。由圖1可知，5℃以上西洋杜鵑的相對(duì)電導(dǎo)率變化較小，說明此溫度對(duì)西洋杜鵑的生長影響較小，5℃以下時(shí)，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，西洋杜鵑的相對(duì)電導(dǎo)率逐漸增大，且隨著脅迫溫度的降低，相對(duì)電導(dǎo)率增大。從脅迫天數(shù)上分析，0℃脅迫2天時(shí)，電導(dǎo)率增幅較大，之后的一天出現(xiàn)小幅度下降，脅迫3天時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率開始迅速增長，總體呈上升趨勢(shì)，說明西洋杜鵑葉片細(xì)胞膜及原生質(zhì)體在0℃低溫脅迫下就已經(jīng)受到較嚴(yán)重的傷害，而且隨著脅迫時(shí)間的延長傷害程度逐漸加深，對(duì)西洋杜鵑的膜結(jié)構(gòu)和膜功能造成了影響。

2.1.2 MDA含量的變化 許多研究表明，MDA含量隨著低溫脅迫的加強(qiáng)而升高，且與細(xì)胞膜透性呈正相關(guān)，而與植物的抗寒性呈負(fù)相關(guān)[15]。由圖2可知，MDA的含量隨著溫度的降低而升高，這是由于細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化加劇，損害了膜結(jié)構(gòu)和膜脂功能，MDA含量急劇增加。在相同的溫度下，MDA含量隨著脅迫時(shí)間的延長而增加，隨著溫度降低，這種變化也越激烈。

2.1.3 可溶性糖含量的變化 可溶性糖是抗寒作用中的一個(gè)滲透調(diào)節(jié)因子，可溶性糖含量的增加能夠提高細(xì)胞液的濃度，降低細(xì)胞冰點(diǎn)，同時(shí)還保護(hù)蛋白質(zhì)，避免凝固作用，且可溶性糖及與之共存的可溶性物質(zhì)，如脯氨酸含量的增加與植物的抗寒性密切相關(guān)。當(dāng)植物體受到低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)的可溶性糖含量就會(huì)增加來保護(hù)膜系統(tǒng)不受到傷害，可溶性糖含量增幅與品種抗寒性呈正相關(guān)[15]。不同低溫脅迫處理后，西洋杜鵑葉片可溶性糖含量發(fā)生較大的規(guī)律性變化。由圖3可知，脅迫溫度越低，西洋杜鵑葉片內(nèi)的可溶性糖含量越高，增幅隨時(shí)間的延長也越大。10℃以下時(shí)西洋杜鵑葉片可溶性糖含量增加較明顯，說明此時(shí)西洋杜鵑已經(jīng)開始受到低溫脅迫的影響，葉片通過增加可溶性糖含量來避免細(xì)胞膜受降解和破壞，從而提高對(duì)低溫脅迫環(huán)境的適應(yīng)性[16]。

2.1.4 脯氨酸含量的變化 大量研究結(jié)果表明，游離脯氨酸含量的高低反映園林植物的抗寒性，且呈正相關(guān)[15]。低溫脅迫條件下，游離脯氨酸的含量迅速上升，發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)作用，防止膜質(zhì)和蛋白的過氧化作用[17]。據(jù)圖4可知，隨著脅迫溫度的降低，西洋杜鵑葉片脯氨酸含量增加，但增加量不顯著，在相同溫度下，隨著脅迫時(shí)間的延長，脯氨酸含量緩慢增加，變化不明顯，說明低溫逆境給西洋杜鵑產(chǎn)生了一定程度的傷害。

2.1.5 可溶性蛋白含量的變化 低溫脅迫條件相同，可溶性蛋白含量越高，植物的抗寒性就越高[15]。由圖5可知，隨著脅迫溫度的降低，西洋杜鵑葉片可溶性蛋白顯著增加，在相同溫度下，隨著脅迫時(shí)間的延長，可溶性蛋白含量也呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，尤以10℃以下處理溫度變化顯著，說明低溫脅迫下植物通過增加可溶性蛋白的含量來提高抗寒性。

2.1.6 保護(hù)酶SOD、POD、CAT活性的變化 超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）是保護(hù)酶系統(tǒng)的主要組成物質(zhì)，又稱為活性氧清除劑。保護(hù)酶系統(tǒng)能夠使細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，體現(xiàn)了植物的自我防御功能。植物體內(nèi)SOD和POD的含量對(duì)抵御低溫傷害呈一定正相關(guān)性。植物在低溫脅迫環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生一定量的SOD和POD，從而提高SOD和POD的活性[18]，SOD能將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿友鹾瓦^氧化氫，POD又把過氧化氫氧化分解成水和氧氣[15]。由圖6～7可知，隨著脅迫溫度的降低，SOD和POD活性呈上升趨勢(shì)，在相同溫度下，隨著脅迫時(shí)間的延長，SOD呈上升-下降-上升趨勢(shì)，總體呈上升趨勢(shì)；POD呈下降-上升趨勢(shì)，總體呈上升趨勢(shì)。CAT是植物在低溫脅迫時(shí)清除體內(nèi)H2O2的主要酶類[19]，從圖8可以看出，隨著脅迫溫度的降低，CAT活性增加，在相同溫度時(shí)，隨著脅迫時(shí)間的延長，CAT活性增加，在10℃時(shí)CAT活性增加量較少，脅迫2天后趨于穩(wěn)定，說明10℃低溫對(duì)西洋杜鵑傷害較小。

2.2 各生理生化指標(biāo)的方差分析

在人工低溫脅迫環(huán)境影響下，對(duì)西洋杜鵑葉片相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸含量、MDA 含量及保護(hù)酶活性等8個(gè)生理指標(biāo)的變化進(jìn)行方差分析（表1）。通過對(duì)數(shù)據(jù)的方差分析可知，不同處理時(shí)間和不同處理溫度下西洋杜鵑葉片MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和CAT活性的差異均達(dá)到了極顯著水平（P=0.0001<0.01），而在兩者交互作用時(shí)，僅相對(duì)電導(dǎo)率和脯氨酸含量的差異達(dá)到了顯著水平（P<0.05），其余生理生化指標(biāo)的差異不明顯（P>0.05）。

2.3 各生理生化指標(biāo)的多重比較

對(duì)不同時(shí)間處理下的西洋杜鵑相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行差異多重比較分析（表2）。數(shù)據(jù)分析表明，經(jīng)過4天低溫脅迫處理后，各生理生化指標(biāo)與對(duì)照的差異均達(dá)到極顯著水平，說明4天的抗寒鍛煉明顯提高了西洋杜鵑抗寒性。

對(duì)不同溫度處理下的西洋杜鵑相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行差異多重比較分析（表3）。數(shù)據(jù)分析表明，在不同的溫度脅迫處理下，所有的生理生化指標(biāo)與對(duì)照處理間的差異達(dá)到了極顯著水平。0℃和3℃處理時(shí)各個(gè)指標(biāo)與5℃和10℃處理間的差異達(dá)到了極顯著水平，說明在0℃和3℃低溫脅迫下，西洋杜鵑的抗寒能力明顯提高。

3 結(jié)論

在低溫脅迫下，植物正常代謝失衡，MDA含量提高，保護(hù)酶活性增大，可以通過保護(hù)酶活性的提升增強(qiáng)對(duì)低溫的抵御能力，同時(shí)葉片的滲透調(diào)節(jié)能力也失衡，可以靠提高可溶性物質(zhì)含量來增強(qiáng)抗寒性。本實(shí)驗(yàn)中，主要依靠可溶性糖和可溶性蛋白的含量來增強(qiáng)抗寒性。且溫度越低，保護(hù)酶活性和可溶性物質(zhì)的含量越高，在0℃時(shí)西洋杜鵑的新陳代謝嚴(yán)重失衡，植物受到的傷害需要較長的時(shí)間恢復(fù)甚至無法恢復(fù)。

受時(shí)間和條件的限制，本實(shí)驗(yàn)只對(duì)西洋杜鵑葉片部分的生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定和分析，未對(duì)西洋杜鵑葉片超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，亦未對(duì)西洋杜鵑的根部進(jìn)行采樣測(cè)定分析，找出根部和葉片、地上和地下部分的相關(guān)性，從而系統(tǒng)全面地解釋植物的抗寒機(jī)制，下一步實(shí)驗(yàn)將對(duì)此部分內(nèi)容進(jìn)行探討研究，使研究內(nèi)容更加全面。

4 討論

在本實(shí)驗(yàn)研究中，西洋杜鵑‘粉紅品種在不同低溫脅迫下MDA的含量都呈上升趨勢(shì)，和前人研究的結(jié)果一致[20-21]，在3℃和5℃脅迫初期MDA含量有小幅度的下降但總體還是高于對(duì)照含量，這可能與保護(hù)酶活性有關(guān)。電導(dǎo)率在不同低溫處理下，隨著時(shí)間的延長總體呈上升趨勢(shì)，與其他研究者的研究結(jié)果相一致[22-23]。SOD活性的提高催化了超氧陰離子自由基的歧化作用，形成分子氧和過氧化氫；POD和CAT活性的提高能有效的清除植物體內(nèi)的過氧化氫，在不同的低溫脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長，CAT總體呈逐漸上升趨勢(shì)，SOD呈上升-下降-上升趨勢(shì)，POD呈下降-上升趨勢(shì)，說明在低溫脅迫初期，活性氧的清除主要靠CAT和SOD，脅迫后期，活性氧的清除主要靠SOD、CAT和POD。在0℃時(shí)，雖然3種保護(hù)酶活性都有大幅提高，但是MDA的急劇上升對(duì)西洋杜鵑卻產(chǎn)生了傷害，而在3℃、5℃和10℃時(shí)MDA隨著脅迫時(shí)間的延長上升幅度較小，因而對(duì)植物產(chǎn)生的傷害也較小。

此外，可溶性糖和可溶性蛋白在低溫脅迫下隨著脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與前人的研究結(jié)果相一致[24-26]，5℃和10℃時(shí)可溶性糖隨脅迫時(shí)間的延長增幅較小，這可能與相同時(shí)間MDA的含量增幅不大有關(guān)，說明植物受低溫脅迫傷害較小，可溶性糖的合成只用于植物正常代謝功能的消耗。而在0℃和3℃時(shí)可溶性糖隨脅迫時(shí)間的延長增幅較大，這可能與淀粉大量水解，植物呼吸作用減弱，需要大量的能量來抵御寒冷有關(guān)。游離脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)維持細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力，阻止水分喪失發(fā)揮重要作用，更有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)和膜系統(tǒng)[27-28]。而在本實(shí)驗(yàn)中游離脯氨酸隨脅迫溫度的降低和脅迫時(shí)間的延長變化不大，主要靠可溶性糖和可溶性蛋白來提高植物的抗寒性，有研究者認(rèn)為脯氨酸在增強(qiáng)植物抗寒性方面沒有積極的作用[29]，是植物在低溫鍛煉下的一種被動(dòng)行為，因而為本次實(shí)驗(yàn)西洋杜鵑脯氨酸含量的變化提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 賈軍.比利時(shí)杜鵑研究進(jìn)展[J].中國花卉園藝，2002（4）.

[2] 李葉云，龐磊，陳啟文，等.低溫脅迫對(duì)茶樹葉片生理特性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，40（4）：134-138，145.

[3] 張麗，周欣，蔣家月，等.外源ABA對(duì)茶樹抗寒生理指標(biāo)的影響[J].茶葉通報(bào)，2012，34（2）：72-74.

[4] 張靜，朱為民.低溫脅迫下番茄細(xì)胞膜保護(hù)酶活性的變化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（6）：121-124.

[5] 程群科，羅慶煕，李利蘭，等.番茄抗冷性的研究進(jìn)展[J].長江蔬菜：學(xué)術(shù)版，2012（8）：14-16.

[6] 孔祥生，易現(xiàn)峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008：248-250.

[7] 中國科學(xué)院上海植物生理研究所，上海市植物生理學(xué)會(huì).現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社，1999：305-306.

[8] 張治安，陳展宇.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].長春：吉林大學(xué)出版社，2008：192-193.

[9] 鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：161-162.

[10] 高俊鳳.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2006：228-231.

[11] 周廣生，梅方竹，周竹青，等.小麥不同品種（系）耐濕性的綜合評(píng)價(jià)[J].生物數(shù)學(xué)學(xué)報(bào)，2003，18（1）：98-104.

[12] 陳建勛，王曉峰.植物生理試驗(yàn)指導(dǎo)（第二版）[M].華南理工出版社.

[13] 張志良，瞿偉青.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2002：65-66.

[14] 劉冰，王有科.應(yīng)用Logistic方程確定花椒枝條低溫半致死溫度[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（4）：475-479.

[15] 張兆英，宋立立.園林植物抗寒性鑒定指標(biāo)的分析[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（2）：60-62.

[16] 闕生全，胡丹，張燕.低溫脅迫對(duì)彩色馬蹄蓮生理生化特性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（2）：486-487.

[17] 和紅云，田麗萍，薛琳.植物抗寒性生理生化研究進(jìn)展[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，13（2）：10-13.

[18] 鐘泰林，李根有，石柏林.低溫脅迫對(duì)四種野生常綠藤本植物抗寒性生理指標(biāo)的影響[J].北方園藝，2009（9）：161-164.

[19] 張學(xué)財(cái)，周文釗，李俊峰.低溫脅迫下4個(gè)劍麻品種的SOD、POD、CAT變化[J].中國熱帶農(nóng)業(yè)，2009：47-50.

[20] 孫存華，孫存玉，張亞紅，等.低溫對(duì)香樟膜脂過氧化和保護(hù)酶活性的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（4）：58-60，65.

[21] 王萍，張成軍，陳國祥，等.低溫對(duì)水稻劍葉膜脂過氧化和脂肪酸組分的影響[J].作物學(xué)報(bào)，2006，32（4）：568-572.

[22] 劉曉芳，李萍.紫葉白蠟抗寒性研究[J].防護(hù)林科技，2008（5）：1-2，5.

[23] 李萍，劉曉芳，黃閩敏，等.紫葉稠李抗寒性研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24（4）：16-18.

[24] 劉春英，陳大印，蓋樹鵬，等.高低溫脅迫對(duì)牡丹葉片PSII功能和生理特性的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，23（1）：133-139.

[25] 李春燕，陳思思，徐雯，等.苗期低溫脅迫對(duì)揚(yáng)麥16葉片抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響[J].作物學(xué)報(bào)，2011，37（12）：2293-2298.

[26] 何麗斯，汪仁，孟祥靜，等.榮莉扦插苗對(duì)模擬低溫的生理響應(yīng)[J].西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（12）：2451-2458.

[27] Farah Anjum， Vikas Rishi， Faizan Ahmad. Compatibility of osmolytes with Gibbsenergy of stabilization of proteins [J].Biochimica Biophysica Acta，2000，1476（1）：75-84.

[28] Matysik， Bhalu B， Mohanty P. Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by proline under stressing plants[J].Current Science，2002，82（5）：525-532.

[29] Wanner L A， Junttila O. Cold induced freezing-tolerance in Arabidopisis[J]. Plant Physiology，1999，120（7）：391-399.