生物技術在草莓遺傳育種中的應用

溫映紅　楊明霞　王俊宇　韓鳳

摘 要：概述了近年來國內外關于生物技術在草莓遺傳育種中的應用研究進展。重點對草莓組織培養技術、分子標記技術、基因工程技術在草莓遺傳育種中發揮的作用及應用現狀進行了總結，主要包括組織培養應用于草莓育苗，利用分子標記進行遺傳圖譜構建及抗病性輔助選擇，利用基因工程技術進行草莓基因功能驗證及遺傳性狀定向改良等，分析了各種現代生物技術應用于育種研究的可行性。最后，對各種生物技術的局限性進行了總結和歸納，探討了現代生物技術與常規育種技術相結合的利用途徑及發展方向，旨在為今后草莓遺傳育種工作提供參考和理論依據。

關鍵詞：生物技術；草莓；遺傳育種

中圖分類號：Q789 文獻標志碼：A 論文編號：2014-0209

Application of Biotechnology in Genetics and Breeding of Strawberry

Wen Yinghong， Yang Mingxia， Wang Junyu， Han Feng

（Pomology Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taigu 030815， Shanxi， China）

Abstract： This review introduced the progress about application of biotechnology in the strawberry genetics and breeding from abroad and home researches in recent years. The role and the status of application about tissue culture technology， molecular markers and genetic engineering technology in the strawberry genetics and breeding were summarized mainly including the application of tissue culture in strawberry breeding， the using of molecular markers about the constructing of genetic maps and molecular marker-assisted selection for disease resistance， the using of genetic engineering technology about functional verification of strawberry genes and the directional genetic improvement of horticultural traits and so on. The feasibility of modern biotechnologies were applied to breeding research was analyzed as well. Finally， the limitations of various biotechnologies were summarized， the utilization way and development direction of modern biotechnology combined with conventional breeding technology was discussed. Overall， this review aimed at offering basic knowledge about genetic breeding work of strawberry.

Key words： Biotechnology； Strawberry； Genetics and Breeding

0 引言

草莓是薔薇科草莓屬的一種多年生宿根草本植物，是溫帶地區的一種常見水果。其果實營養價值較高，因此深受人們喜愛。草莓在各種漿果中，全球栽培面積和產量均位居前列。近年來，國內草莓產業發展迅速，草莓栽培面積也在不斷擴大。良好的發展前景為草莓遺傳育種工作帶來新的機遇。

長久以來，草莓育種者已經利用常規育種方法培育了許多優良草莓品種。隨著草莓產業的迅速發展，生產上對優質草莓種苗的需求不斷增加，同時為適應國際市場，不同類型草莓品種的需求也在不斷增長。常規育種方法往往由于育種周期長以及大量的人力物力消耗等原因而無法滿足日益增長的草莓生產發展需要。近些年現代生物技術的興起為目前植物遺傳育種工作帶來了新的前景，同時已顯示出巨大潛力。生物技術在草莓遺傳育種上的應用發展與其他主要作物相比進展較慢，但隨著先進技術的不斷涌現，生物技術對草莓遺傳育種工作起到了顯著的推動作用，同時也取得了一定的成績。筆者主要概述了目前現代生物技術在草莓遺傳育種中的應用與研究進展，探討生物技術應用于植物遺傳育種工作的發展方向。

1 組織培養與草莓遺傳育種

草莓組織培養研究較早，莖尖、葉片、花藥、原生質體等組織器官培養方面的研究均比較全面，因此組織培養將成為草莓品種改良的一種重要措施。盡管草莓組培苗在生產上的應用越來越廣泛，但是近年來多項研究表明，組培效應會導致草莓組培苗發生體細胞無性系變異。Morozova[1]研究表明，草莓的離體培養和再生植株會發生形態學、細胞學和遺傳物質等方面的變異。張馨宇等[2]發現草莓組培苗繁殖的匍匐莖子苗數量顯著高于普通苗并且后代在結果期生長勢較強，產量增加，但抗病性會有所下降，這種變異被認為是一種表觀遺傳變異。因此組培誘導的這些變異具有兩重性，一方面將影響生產上用苗的品種一致性以及果實產量與質量，而另一方面也為草莓的種質創新及新品種的選育創造了一個新的途徑。組培誘導效應引起植物變異的機理至今還不是很清晰，加強這方面的理論研究對今后的草莓遺傳育種工作具有重要的創新意義。

1.1 草莓莖尖、葉片、花瓣培養

草莓莖尖培養是進行草莓種苗脫毒的主要方法。草莓匍匐莖的莖尖是較為方便且常用的取材部位，莖尖和分生組織培養在遺傳與形態上較其他部位穩定[3]，而且更容易再生，適于大量擴繁。近些年很多研究者對草莓莖尖培養的培養基選擇及培養方式等方面進行了較為全面的研究[4-5]，這為草莓組培苗應用于生產及工廠化育苗提供了一定的理論基礎。草莓葉片、花瓣等器官培養可以通過誘導草莓離體器官再生獲得穩定的草莓再生體系，從而獲得大量的植物材料，為后續遺傳轉化與新品種選育工作奠定基礎。董莉等[6]以草莓組培苗葉片為試材建立了‘紅顏草莓葉片高效再生體系。顧地周等[7]通過誘導深山草莓花瓣愈傷組織獲得了再生植株，并證明在適當激素和濃度配比條件下可誘導產生穩定性狀變異植株。

1.2 草莓子房、花藥與小孢子培養

人工誘導草莓單倍體植株可以通過未受精子房離體培養以及花藥或小孢子培養2種方式獲得。單倍體誘導對于植物倍性育種具有重要的意義，可以有效縮短育種年限。王文和等[8]研究證明離體培養草莓未受精子房獲得單倍體植株的關鍵在于試材的選擇、激素與蔗糖濃度以及溫度的控制。趙永欽等[9]通過對草莓花藥培養中預處理方式、花序以及激素種類和配比對愈傷組織形成的影響研究，探索了以草莓花藥培養獲得單倍體植株的最適培養條件。王萌[10]對野生草莓游離小孢子進行培養，研究了草莓游離小孢子培養的影響因素并獲得了小孢子發育而來的胚狀體，這是對草莓游離小孢子培養體系的首次探索。

1.3 草莓原生質體培養

原生質體培養在植物遺傳轉化、克服遠緣雜交障礙、分離和純化突變體等方面起到重要作用，這也是草莓育種的一種重要方法。張學英等[11]對草莓原生質體分離過程中的多項影響因素進行了深入研究，探討了草莓原生質體分離時最佳的分離材料、酶液組成、酶解方式及時間等控制條件，為草莓的原生質體培養和融合等方面研究提供了很有價值的理論基礎。馮穎等[12]將長白山區東方草莓和安娜草莓的原生質體融合并培養獲得了屬間體細胞融合的新植株，這證明了草莓原生質體培養與融合應用于草莓育種的可行性。

2 分子標記與草莓遺傳育種

分子標記即一種遺傳標記，實質上是能直接反映基因組DNA間差異的DNA片段，其可以反映生物個體以及種群間基因組中的某種差異。分子標記主要可以分為以分子雜交為基礎的分子標記、以PCR為基礎的分子標記、以DNA芯片和測序為基礎的分子標記3類。DNA分子標記與細胞學標記、形態標記、生化標記等相比，具有顯著優越性，因此DNA分子標記已被廣泛應用于多種植物基因組作圖、基因定位、基因克隆等遺傳育種工作。在近些年草莓遺傳育種工作中，分子標記技術在遺傳圖譜構建、抗病性輔助選擇育種等方面起到了突出作用。

2.1 基于分子雜交的分子標記

RFLP是最早應用于遺傳研究的分子標記，其以Southern雜交為基礎，但其成本較高，技術難度較大。在RFLP的基礎上，設計限制性內切酶及PCR引物可將其轉化為成本適宜且易于操作的PCR-RFLP標記（即CAPS標記），這樣更利于分子圖譜構建及分子育種研究。Kunihisa等[13]成功開發出了可以對不同草莓品種進行有效區分的PCR-RFLP標記，這對育種者權利保護起到重要作用。此外，GISH與FISH技術也是以分子雜交為基礎的。翁天均[14]首次利用FISH與GISH技術對原產中國以及其他國家地區的48份材料進行了系統分類、親緣關系和多倍體形成等方面的分析與研究，這為草莓屬植物系統分類與進化以及多倍體來源研究提供了重要參考依據。馬鴻翔等[15]利用GISH對黃毛草莓×鳳梨草莓雜種F1的五倍體植株進行檢測，從而對黃毛草莓與鳳梨草莓的種間雜交真實性進行了證實。

2.2 基于PCR的分子標記

基于PCR的分子標記是種類最多的一類，包括RAPD、AFLP、SSR、SCAR等。近年來這一類型的分子標記研究最為廣泛。朱海生等[16]利用RAPD分析了不同繼代次數草莓組培苗遺傳穩定性。韓柏明等[17]利用基于AFLP的一種甲基化敏感擴增多態性標記（MSAP）分析了草莓組培苗基因組DNA甲基化程度與DNA甲基化模式的變異。因此分子標記可在草莓遺傳穩定性研究中起到重要作用。王志剛等[18]曾以RAPD和SCAR標記為基礎對草莓品種進行鑒定。Yoon等[19]利用SSR標記分析了不同來源栽培草莓的遺傳多樣性及群體構成。Isobe等[20]利用從已公布的草莓基因序列中收集的4474個SSR標記構建了一套綜合完整的草莓基因連鎖圖譜，這對草莓遺傳信息分析具有重要意義。曹嫻等[21]利用SSR分子標記技術分別獲得了與草莓灰霉病抗性基因連鎖的SSR分子標記，而李靜等[22]利用SSR建立了草莓抗炭疽病遺傳圖譜。這說明分子標記可應用于草莓抗病輔助選擇育種實踐。

2.3 基于DNA芯片和測序的分子標記

SNP是在動植物體內均廣泛存在的遺傳標記。SNP在遺傳變異連鎖作圖、關聯分析、群體分析等遺傳育種工作中具有重要意義，但由于其以芯片技術與測序為基礎，成本消耗高，因此在多數植物研究中還未得到普及。目前，部分研究者已將SNP標記利用到草莓研究當中。Ge等[23]通過比較16種栽培于南京的草莓品種的EST序列，發現了116個SNP位點并用這些SNP多態性標記進行了系統進化分析，說明SNP標記可作為品種鑒定與遺傳多樣性分析的強大工具。野生二倍體草莓F. vesca基因組的公布[24]以及其他草莓種類的基因組數據的不斷更新將有效加快草莓SNP的預測與確認過程，這將對目前栽培草莓的起源與異源多倍體構成等方面的研究有極大的促進作用[25]。

3 基因工程與草莓遺傳育種

植物基因工程是在分子生物學與分子遺傳學等綜合學科基礎上建立起來的以植物基因結構功能研究、新品種選育與品種改良等為主要目標的一種現代生物技術。盡管轉基因技術在有關食品安全以及生態平衡等方面仍存在諸多爭議，但這一技術在理論研究以及部分物種品種選育與改良上已經取得很多成果。基因工程技術在草莓上的應用也漸趨廣泛。通過基因工程手段可以驗證草莓基因功能，縮短草莓育種周期，進行品種遺傳性狀的定向改良，有效提高育種效率。

3.1 農桿菌介導的葉盤轉化法

植物遺傳轉化有多種方法，例如農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等。在草莓遺傳轉化方面應用最為廣泛的方法是農桿菌介導的葉盤轉化法。近年來，國內外許多研究者利用農桿菌介導法進行草莓轉基因研究，同時在抗蟲害、抗病毒與真菌、抗逆性、抗除草劑等諸多方向上獲得轉基因植株[26]，開辟了新的草莓育種途徑。但是這種方法存在一定的缺陷，主要體現在這種方法受較多因素的影響，其轉化效率較低。Husaini[27]就曾對農桿菌介導的草莓微繁殖苗轉化過程進行深入研究，其認為培養時間和篩選條件等對轉化率有較大影響。Pantazis等[28]研究了一種在森林草莓上快捷高效篩選鑒定轉化植株的方法，其利用一種轉入Ac/Ds轉座子標簽系統的農桿菌進行草莓轉化，并在擬轉化植株移栽后進行巴龍霉素噴霧試驗的方法，可以對轉化植株進行快速篩選鑒定。

3.2 RNAi技術

RNAi又稱基因沉默，是一種應用于基因研究的新技術。該技術可以在基因表達、調控與功能研究以及植物品種品質改良中起到重要作用，為反向遺傳學研究提供了一條新的便捷途徑。近年來，RNAi技術在草莓基因功能與品質改良方面的研究逐漸增多。Muňoz等[29]應用RNAi技術證明了Fra a（一種編碼草莓過敏原蛋白的基因）在草莓類黃酮生物合成途徑中具有重要作用。Lin等[30]通過沉默FaDFR基因使得草莓果實顏色變淺，證明FaDFR基因是草莓果實花青素生物合成途徑中的關鍵基因之一。同時，以RNAi理論為基礎而出現的VIGS（病毒誘導的基因沉默）也在草莓研究中得到應用。Jia等[31]利用VIGS技術使FaNCED1以及一種ABA受體基因FaCHLH表達下調均能使草莓果實無法轉紅，但外源ABA處理能夠恢復FaNCED1下調的果實的著色卻不能使FaCHLH下調的果實顏色得到恢復，從而驗證了ABA在果實成熟調控過程中起到重要作用。這都為草莓果實色素形成機理及品質改良提供一定理論依據。

4 展望

綜上所述，現代生物技術在草莓遺傳育種研究中得到廣泛應用并取得一定進展。隨著生物技術方法的不斷創新，尤其是基因組學、轉錄組學以及蛋白組學等方面研究的不斷深入，現代生物技術將逐漸成為植物遺傳育種與品種改良的一種重要手段。但這些技術仍然存在一定的局限性，仍需大量深入研究而彌補缺陷。這主要體現在以下幾點：（1）組培誘導的草莓遺傳變異機理尚不明確，尤其是表觀遺傳變異機理研究仍需進一步深入探討。（2）分子標記在草莓上的應用仍落后與其他多年生果樹，大多集中于質量性狀研究。（3）草莓遺傳轉化效率低，穩定性差，并且基因工程技術仍存在一定風險，轉基因安全性尚需深入研究。

因此，現代生物技術尚難取代常規育種技術在草莓遺傳育種中的地位，但是若將現代生物技術與常規育種技術有效結合，比如利用新技術加快種質創新與鑒定，加強分子標記輔助選擇在常規育種中的應用，建立安全、穩定、高效的草莓遺傳轉化體系等，這將有效促進草莓抗病、抗逆、優質、豐產、耐儲等育種目標的實現，為草莓產業發展創造更多機遇。

參考文獻

[1] Morozova T. Genetic stability of pure line of （Fragaria vesca L.） in micro-propagated and long term storage in vitro[J]. Acta Horticulturae，2003，567：85-88.

[2] 張馨宇，張志宏，高秀巖，等.草莓微繁殖苗及其后代性狀表觀遺傳變異研究[J].果樹學報，2006，23（4）：542-546.

[3] Debnath S C. Propagation Strategies and Genetic Fidelity in Strawberries[J]. International Journal of Fruit Science，2013，13（1-2）：3-18.

[4] 樸日子，曹后男，宗成文.影響“達賽萊克特”草莓莖尖培養因素的研究[J].延邊大學農學學報，2009，31（3）：184-188.

[5] 王燕，陳丙義，章鎮，高志紅，等.黃毛草莓組織培養與快繁技術研究[J].西南農業學報，2012（1）：252-256.

[6] 董莉，晁慧娟，董清華，等.紅顏草莓葉片再生體系的建立[J].中國農學通報，2010，26（10）：246-249.

[7] 顧地周，朱俊義，馮穎，等.深山草莓花瓣離體誘導變異株系及其品種特性[J].中國農學通報，2010，26（20）：27-32.

[8] 王文和，吳祿平，趙玉萍，等.草莓未受精子房離體雌核發育的研究[J].園藝學報，2011，38（8）：1455-1461.

[9] 趙永欽，吳新新，鄭禾，等.草莓‘甜查理和‘章姬花藥培養及單倍體植株的獲得[J].中國農業大學學報，2012，17（5）：39-45.

[10] 王萌.草莓小孢子培養與離體誘導染色體加倍研究[D].南京：南京農業大學，2011.

[11] 張學英，葛會波，劉艷萌，等.草莓原生質體分離條件的研究[J].分子植物育種，2006，4（6）：147-152.

[12] 馮穎，顧地周，朱俊義，等.草莓屬間體細胞融合研究[J].江蘇農業科學，2013，41（3）：29-31.

[13] Kunihisa M， Matsumoto S. Discrimination of strawberry varieties by a DNA analysis[J]. Agriculture and Horticulture，2004，79（1）：180-184.

[14] 翁天均.基于45SrDNA-FISH與GISH分析的草莓屬（Fragaria）野生種親緣關系與系統分類研究[D].重慶：西南大學，2011.

[15] 馬鴻翔，陳佩度，余桂紅，等.利用GISH和RAPD檢測黃毛草莓×鳳梨草莓種間雜種[J].植物遺傳資源學報，2005（3）：256-261.

[16] 朱海生，李永平，林琿，等.草莓品種的親緣關系及其不同繼代次數的葉片組培苗的RAPD分析[J].核農學報，2010，24（2）：264-268.

[17] 韓柏明，趙愷，李賀，等.組織培養導致的草莓DNA甲基化變異[J].植物生理學通訊，2010（8）：797-802.

[18] 王志剛，張志宏，李賀，等.利用RAPD和SCAR標記鑒定草莓品種[J].園藝學報，2007，34（3）：591-596.

[19] Yoon M Y， Moe K T， Kim D Y， et al. Genetic diversity and population structure analysis of strawberry （Fragaria × ananassa Duch.） using SSR markers[J]. Electronic Journal of Biotechnology，2012，15（2）：6.

[20] Isobe S N， Hirakawa H， Sato S， et al. Construction of an Integrated High Density Simple Sequence Repeat Linkage Map in Cultivated Strawberry （Fragaria × ananassa） and its Applicability[J]. DNA research，2013，20（1）：79-92.

[21] 曹嫻，高清華，聶京濤，等.草莓灰霉病抗性遺傳分析和分子標記初定位[J].上海交通大學學報：農業科學版，2011（4）：18.

[22] 李靜，高志紅，段可，等.草莓抗炭疽病遺傳圖譜及其QTL初分析[J].核農學報，2012，26（2）：250-256.

[23] Ge A J， Han J， Li X D， et al. Characterization of SNPs in strawberry cultivars in China[J]. Genetics and molecular research，2013，12（1）：639.

[24] Shulaev V， Sargent D J， Crowhurst R N， et al. The genome of woodland strawberry （Fragaria vesca）[J]. Nature genetics，2010，43（2）：109-116.

[25] Kaur S， Francki M G， Forster J W. Identification， characterization and interpretation of single-nucleotide sequence variation in allopolyploid crop species[J]. Plant biotechnology journal，2012，10（2）：125-138.

[26] 秦永華，張上隆.草莓轉基因研究進展[J].遺傳，2007，29（2）：150-156.

[27] Husaini A M. Pre-and post-agroinfection strategies for efficient leaf disk transformation and regeneration of transgenic strawberry plants[J]. Plant cell reports，2010，29（1）：97-110.

[28] Pantazis C J， Fisk S， Mills K， et al. Development of an efficient transformation method by Agrobacterium tumefaciens and high throughput spray assay to identify transgenic plants for woodland strawberry （Fragaria vesca） using NPTII selection[J]. Plant cell reports，2013，32（3）：329-337.

[29] Mu?oz C， Hoffmann T， Escobar N M， et al. The strawberry fruit Fra a allergen functions in flavonoid biosynthesis[J]. Molecular plant，2010，3（1）：113-124.

[30] Lin X， Xiao M， Luo Y， et al. The effect of RNAi-induced silencing of FaDFR on anthocyanin metabolism in strawberry Fragaria × ananassa fruit[J]. Scientia Horticulturae，2013，160：123-128.

[31] Jia H F， Chai Y M， Li C L， et al. Abscisic acid plays an important role in the regulation of strawberry fruit ripening[J]. Plant Physiology，2011，157（1）：188-199.