利用SRAP標記分析春蘭種質資源遺傳多樣性

牛田等

摘 要：利用SRAP分子標記對42份春蘭品種及1份多花蘭、1份春劍及3份雜交蘭進行遺傳多樣性分析。篩選出的15對引物組合共擴增出185個位點，其中多態性位點184個，平均每對引物組合產生12.27個多態性位點。引物組合Me8-Em16的Neis基因多樣性數H（0.3993）、Shannon信息指數I值（0.5794）和有效等位基因數Ne（1.7280）都是最高值。47份材料的遺傳相似系數變化范圍為0.63～0.80，UPGMA聚類分析表明，在遺傳相似系數為0.662處，將47份材料劃分成5個類群。本研究較好地揭示了47份材料親緣關系的遠近，為春蘭各品種間的分類和雜交親本的選擇提供重要理論依據。

關鍵詞：春蘭；SRAP；遺傳多樣性；聚類分析；親緣關系

中圖分類號：S311 文獻標志碼：A 論文編號：2013-1027

Genetic Diversity Analysis of Cymbidium goeringii 's Germplasm Resources Based on SRAP Markers

Niu Tian1， Zhang Lin2， Wang Houxin2， Li Chengxiu2， Nie Shuo1， Zhu Cuicui1， Wang Changxian2

（1College of Forestry， Shandong Agriculture University， Taian 271018， Shandong， China；

2Taishan Forestry Academe， Taian 271000， Shandong， China）

Abstract： SRAP was used to analyse the genetic diversity analysis of 42 Cymbidium goeringii cultivars and 1 specie of Cymbidium floribundum， 1 specie of Cymbidum longibracteatum and 3 species of hybrid Cymbidium. 15 polymorphic primer combinations were screened and a total of 185 DNA loci were amplified，184 of which were polymorphic. The average number of polymorphic DNA loci amplified by each primer was 12.27. Primer combination Me8-Em16s Neis genetic diversity index （0.3993）， Shannon's information index （0.5794） and Effective number of alleles （1.7280） were the highest. The genetic similarity among 47 germplasm ranged from 0.63-0.80. The UPGMA clustering showed that all the tested cultivars and species were classified into five cluster groups with the similarity coeficient of 0.662. The study were well revealed the 47 materials genetic relatives. The findings of this study would provide an important theoretical basis for Cymbidium goeringii classification and parental selection in cross breeding.

Key words： Cymbidium goeringii； SRAP； Genetic Diversity； Cluster Analysis； Genetic Relationship

0 引言

春蘭（Cymbidium goeringii）屬于蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium），別名朵朵香、草蘭、草素、山花等，地生蘭原種，室內觀賞盆栽花卉。在中國江浙地區分布較廣，福建、廣東、四川、云南、安徽、江西、臺灣等地亦有出產，有肉質根及球狀的擬球莖，葉叢生而剛韌，狹長而尖，邊緣粗糙；假鱗莖稍呈球形，葉4～6枚集生，狹帶形，邊緣有細鋸齒；花單生，少數2朵，花葶直立，花期2—3月。蘭花是中國十大傳統名花之一，距今已有2500多年的栽培歷史。其味清幽，花色淡雅，具有較高的觀賞價值。

隨著分子生物學技術的不斷發展，DNA分子標記技術已經逐漸應用到春蘭的鑒定中。目前應用于春蘭分子標記的主要為RAPD、AFLP、ISSR等。季祥彪等[1]采用RAPD標記對貴州野生春蘭遺傳多樣性進行分析；陳慧云等[2]利用AFLP分子標記對部分春蘭名品進行了DNA指紋圖譜分析；春蘭ISSR-PCR反應體系的優化也已見報道[3]。但SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相關序列擴增多態性）是由Li等[4]開發的一種新型的PCR分子標記技術，它針對基因外顯子里GC含量豐富而啟動子和內含子里AT含量豐富的特點來設計引物進行擴增，因不同個體的內含子、啟動子與間隔區長度不等而產生多態性，具有操作簡便、穩定可靠、共顯性高、重復性高、易于分離條帶及測序的特點[5]，在基因組中分布均勻，但是同樣易受到反應條件和擴增程序變化的影響。目前SRAP主要應用于植物種質資源鑒定評價、種緣進化關系、遺傳圖譜構建、基因定位、重要性狀標記以及比較基因組學等方面。目前關于利用SRAP分子標記進行遺傳多樣性分析的文章未見報道，本研究利用SRAP分子標記對42份春蘭品種及1份多花蘭、1份春劍及3份雜交蘭進行遺傳多樣性分析，擬為春蘭各品種間的分類和雜交親本的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為山東省泰安市泰山林業科學研究院生物技術中心提供的42個春蘭不同品種及作為對照材料的1份多花蘭、1份春劍及3種雜交蘭，其品種名及編號詳見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 取幼嫩葉片用硅膠干燥，采用改良的CTAB法[6]提取基因組DNA，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外分光光度計測定其濃度和純度。所有DNA樣品稀釋至50 ng/μL，于-20℃冰箱內保存備用。

1.2.2 SRAP-PCR擴增 采用篩選優化后的SRAP-PCR體系（25 μL），包括超純水14.5 μL，buffer緩沖液2.5 μL，Mg2+濃度2.5 mmol/L，引物濃度為1.2 μmol/L，dNTP濃度2 mmol/L，Taq聚合酶0.5 U，DNA模板為90 ng。擴增程序為：94℃預變性4 min，反應前5個循環為94℃變性1 min、35℃復性1 min、72℃延伸1 min；后30個循環退火溫度50℃，72℃延伸50 s；循環結束后再72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產物檢測 PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TAE，電壓120 V。凝膠經溴化乙錠（EB）染色后置于凝膠成像系統上采集圖像。

1.2.4 數據統計與分析 擴增條帶中只統計清晰、易于辨認的條帶，結果采用二元性狀編碼，即有帶表示為1，無帶表示為0[7-9]。采用POPGENE1.32軟件計算每對SRAP引物的多態性位點數和多態位點百分率，Nei遺傳多樣性指數H和Shannon信息指數I，并利用NTSYS 2.10e軟件根據Nei遺傳相似系數采用UPGMA（未加權平均法）進行聚類[10-12]，并繪出聚類分析樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 多態性分析

本試驗所用的正反向引物序列見表2，從170對引物組合中篩選出條帶清晰穩定、多態性好的引物15對。對47份蘭花種質材料進行PCR擴增（圖1、圖2），擴增結果表明，篩選出的不同引物組合擴增出的DNA片段長度在250～5000 bp。15對引物組合在47份材料中共檢測到185個位點，其中多態性位點184個，多態性比率達99.46%，平均每對引物組合產生12.27個多態性位點。其中引物組合Me6-Em4多態性比率最低為90%；Me8-Em16的Neis基因多樣性數（0.3993）、Shannon信息指數（0.5794）和有效等位基因數（1.7280）都是最高值。

2.2 聚類分析

根據篩選出的15對多態性引物擴增結果，采用UPGMA法進行聚類分析（圖3），得出春蘭種質資源的親緣關系樹狀圖，結果顯示47份蘭花種質資源的遺傳相似系數為0.63～0.80。其中3組品種組合的遺傳相似系數（0.80）最大，分別是同樣來自于浙江紹興的奇花類牡丹瓣的‘天彭牡丹和‘錦繡中華，‘金汪字和‘新梅以及同樣來自于四川成都的梅瓣類的‘綠梅和‘黃梅。在遺傳相似系數為0.662處，將47份材料劃分成5個類群，第Ⅰ類群又在遺傳相似系數為0.67處，劃分為兩大亞類群；第Ⅱ類群都屬于“春蘭老八種”，分別是瓣型為水仙瓣的3號‘汪字和瓣型為梅瓣的7號‘萬字；第III類群為瓣型為荷瓣的5號‘環球荷鼎；第IV類群為瓣型為多瓣的18號‘四喜蝶；第Ⅴ類群又在遺傳相似系數為0.691處，劃分為2個亞類群，其中45號春劍品種‘隆昌素和47號蕙蘭品種為一類；40號多花蘭品種和46號多花蘭與蕙蘭雜交品種為一類，二者表現出較近的親緣關系，主要是46號雜交品種的父母本有一個是多花蘭品種，這與聚類分析結果基本一致。

聚類分析結果表明，來自于相同地區的春蘭品種的親緣關系較近，如在第Ⅰ類群劃分的第2亞類群中，來自于四川成都的38號‘綠梅、41號‘大富貴、42號‘宋梅、43號‘黃梅和44號‘集圓歸為一類，同時與來自于浙江紹興的47號‘新梅正好分開，47號單獨為一類；但也存在著來源于不同地區的品種親緣關系較近的現象，同樣在在第Ⅰ類群劃分的第2亞類群中，來自于四川成都的36號‘簪梅與來自于浙江紹興的27號‘紅宋梅親緣關系較近，劃分為一類，說明不同地區的春蘭品種之間的遺傳距離差距雖然比較遠，但由于各地之間蘭花市場的交易頻繁以及經過人工馴化，來源于不同地區的優良品種間的雜交現象還是存在的。

3 結論

本研究利用篩選出的15對特異性引物組合擴增出185個位點，其中多態性位點184個，多態性比率達99.46%，而朱根發等[13]對大花蕙蘭種質進行AFLP分析時，64對引物中篩選出多態性引物9對，多態性引物比率僅為14.1%。李冬梅等[14]利用RAPD標記分析了大花蕙蘭種質資源親緣關系，100個引物中篩選出20個引物，引物多態性百分率也僅有20%。陳惠云等[2]利用AFLP分子標記技術對18種名貴春蘭品種進行了DNA指紋圖譜分析，篩選出16對引物，共擴增出345條帶，其中有多態性帶169條，多態性百分率為48.99%。李鈞敏等[15]利用RAPD分子標記技術對30個西蘭花栽培新品種進行分析，結果顯示22個特異引物共擴增出229條譜帶，其中多態性條帶有109條，多態性帶比例僅為47.60%。由此可知，SRAP多態性較好，效率也很高，可以提供更豐富的遺傳信息，獲得更可靠的結果。同時本研究所得的結果表明SRAP在春蘭種質遺傳多樣性研究中具有高效性，同時47份材料具有較豐富的遺傳多樣性。

利用SRAP分子標記技術對不同植物擴增結果也是有所不同的，而且效率也是不相同的。歐陽冬梅等[16]利用SRAP標記對來自國內外蓮屬40份材料進行分析。11對特異性引物共擴增了184條條帶，多態性條帶127條，多態性帶比例為69.0%。文雁成等[17]采用SRAP標記對建國以來不同時期選育的130個品種進行分析，25個SRAP引物組合共擴增到509個譜帶，其中123個多態性條帶，多態性帶百分率為24%。趙秀娟等[18]從144對SRAP引物中篩選出61對多態性強、重復性好的SRAP引物，對43份苦瓜種質DNA進行了擴增，共得到2078條譜帶，其中多態性譜帶863條，多態性帶比例為42.11%。以上差異可能與不同植物所具有的基因組不同及所篩選的引物組合不同有關。SRAP在春蘭遺傳多樣性上表現出高效性，將為春蘭親緣關系鑒定方面提供重要技術支撐。

4 討論

從聚類分析樹狀圖可以看出，47份蘭花種質資源的遺傳相似系數為0.63～0.80，各品種間表現出較高的親緣關系；春蘭品種與作為對照的非春蘭品種蕙蘭、多花蘭和春劍等遺傳相似系數（0.63）最小，表現的親緣關系最遠，這與嚴華[19]對不同種國蘭親緣關系的ISSR分析結果基本一致。47份材料在表型性狀中也表現出較高的多樣性，從葉色、葉形、葉姿、花色、瓣型等都表現出很大差異，而其中遺傳相似系數最大（0.80）的2個品種‘天彭牡丹和‘錦繡中華在形態學上也表現出一致性：葉片較長，葉夾角較大，葉姿較直立，葉片為淺綠色，瓣型為奇花類牡丹瓣。但瓣型為水仙瓣的3號‘汪字和梅瓣的7號‘萬字同屬于第Ⅱ類群，這與蘭花傳統瓣型分類存在差異，二者的分類仍有待于進一步研究。

在形態學分類上，春蘭品種主要依據株型、花瓣、花色、葉型、葉藝等形態特征進行區分，有一定的局限性。有關研究報道，在蘭科植物中，如果其他基因插入到控制花顏色的基因中，會導致花顏色的改變[20]。因此，針對內含子和啟動子區域AT含量豐富而與間隔區長度不等而進行特異擴增的SRAP分子標記技術能夠比傳統的形態學分類更為有效地鑒定出春蘭各品種間的親緣關系。

由于整個蘭花市場需求量的不斷加大，蘭花交易額也隨之遞增。目前市場上春蘭等國蘭的價格飆升，導致農民上山大量采挖蘭花野生資源，許多春蘭的名品破壞嚴重，野生資源變得越來越稀缺，因此春蘭種質資源的開發與保護顯得尤為重要。本研究結果表明不同來源地的絕大部分春蘭品種之間的親緣關系距離較遠，因此，地方對春蘭品種種質資源的保護對保持當地春蘭品種豐富的遺傳多樣性具有重要作用。本研究較好地揭示了春蘭各品種之間的親緣關系，但由于技術有一定的局限性，在隨后的工作中將結合其他手段和技術對其做進一步的探索，為春蘭種質資源的利用與保護奠定更堅實的基礎。

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