2013年美國《感染性疾病微生物學實驗室診斷應用指南》簡介
——部分病毒綜合征

寧永忠

2013年美國《感染性疾病微生物學實驗室診斷應用指南》簡介
——部分病毒綜合征

寧永忠

本文主要介紹和討論2013年美國感染性疾病學會和美國微生物學會聯合推薦的《感染性疾病微生物學實驗室診斷應用指南》中關于幾種重要的病毒綜合征的臨床微生物學實驗室檢查。

微生物學；實驗室；傳染病；指南

2013年美國《臨床感染病》雜志發表了美國感染性疾病學會和美國微生物學會聯合推薦的《感染性疾病微生物學實驗室診斷應用指南》[1]。該指南針對感染性疾病的實驗室診斷，幾乎涉及所有感染性疾病、經典病原（朊病毒和病毒、細菌、真菌、寄生蟲等）和臨床檢查［涂片、培養、免疫學、抗原檢查、核酸擴增試驗（nucleic acid amplification tests,NAATs）、耐藥性檢查等］，并強調臨床和實驗室之間的合作，呼吁建立彼此間“緊密的、積極的工作關系”。本文主要介紹和討論幾種重要的病毒綜合征的臨床微生物學實驗室檢查。

1 相關內容簡介

1.1 病毒綜合征實驗室檢查要點①基于患者的年齡、免疫狀態、病史和其他許多變量來考慮病毒綜合征。②對多數病原因子而言，可以采集標本進行檢查。需要額外檢查時，可以采集額外的標本冷凍保存在實驗室。對原始標本進行多種病毒的廣泛檢查是不符合成本-效益原則的。③標本的采集和運輸是獲得可信的病毒學檢查結果的基本保證。應咨詢微生物學實驗室以確定應該采集什么樣的標本，以及如何送達實驗室。④很多實驗室沒有病毒學檢查能力。標本將會送至其他實驗室進行，周轉時間因此會延長。⑤一些病毒因子的交叉反應會導致非特異性血清學結果。⑥免疫力檢查、既往病毒感染（如組織捐獻者）檢查和新發感染檢查可能需要不同的方式，即使考慮是同種病毒也需如此。

1.2 幾種重要的病毒綜合征

1.2.1 Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染EBV是免疫抑制患者單核細胞增多癥和淋巴細胞增殖性疾病的病因。WBC數量增加伴異型淋巴細胞比例升高，常見于EBV相關單核細胞增多癥。嗜異性抗體通常在癥狀開始后6～10 d可以檢測到，病程的第2周或第3周升高，之后逐漸下降，持續1年或更長時間。假陽性結果見于白血病、胰腺腫瘤、病毒性肝炎和巨細胞病毒（cytomegalovirus,CMV）感染等。假陰性結果見于約10%的患者，尤其多見于＜10歲的兒童。

當快速單點檢查（rapid Monospot）或嗜異性檢查結果陰性時，應考慮其他的實驗室檢查（表1），以便將EBV感染與CMV、腺病毒、HIV、岡地弓漿蟲等引起的單核細胞增多癥樣疾病區分開。此時，推薦進行針對病毒衣殼抗原（viralcapsid antigen,VCA）和EB核抗原（Epstein-Barr nuclear antigen,EBNA）的EBV IgG和IgM抗體檢查。有VCA IgM（伴或不伴VCA IgG）抗體存在，而無EBNA抗體存在的情況提示近期原發性EBV感染。EBNA抗體的存在提示感染從標本采集時刻算起已超過6周，因此EBV不可能是病原。原發感染后1～2月或更長時間里會有EBNA抗體產生，終生可以檢測到。90%以上的健康成年人有針對VCA和EBNA抗原的IgG類抗體，5%～10%的EBV感染者未能產生針對EBNA抗原的抗體。

表1 EBV實驗室檢查Table 1 Laboratory diagnosis of EBV

EBV與先天性或獲得性免疫缺陷患者的淋巴細胞增殖性疾病有關，包括嚴重合并免疫缺陷患者、器官移植受者、外周血干細胞移植受者和HIV感染者。EBV相關淋巴細胞增殖性疾病進展前，通過NAATs可能會在外周血標本中檢測到EBV載量增加；有效治療后病毒載量會明顯下降。患者的組織標本可以是單克隆、寡克隆或多克隆病變。活體組織標本中檢測到EBV DNA、RNA或蛋白的存在，即可診斷為EBV相關淋巴細胞增殖性疾病。

NAATs可以用于檢測AIDS相關中樞神經系統淋巴瘤時CSF中的EBV DNA，然而，EBV DNA也可見于其他異常情況（中樞神經系統弓漿蟲病或化膿性腦膿腫）的CSF標本，因此其陽性是非特異性的。CSF檢出抗體提示中樞神經系統感染、血液污染或抗體穿過血腦屏障。CSF/血清抗體指數的計算可能會有意義。

1.2.2 CMV感染免疫功能正常宿主疑似CMV急性感染時，推薦CMV特異性抗體檢查為實驗室診斷首選檢查（表2）。免疫功能正常宿主中，IgM類抗體的存在意味著近期感染。但是，EBV感染或其他病因激活免疫系統后的患者會出現CMV IgM假陽性結果。只有IgG類抗體存在則意味著既往CMV暴露。

對于器官或外周血造血干細胞移植受者，NAATs檢測CMV載量或抗原血癥（很少有實驗室檢測，因為更青睞于NAATs）被用作搶先治療（preemptive therapy）的標志物，用于診斷CMV相關癥狀體征，以及監測抗病毒治療反應。用于CMV載量檢查的標準參考物質（Standard Reference Material, SRM）由國家標準和技術機構提供。SRM2366含有細菌人工染色體，染色體上有CMV Towne株的基因組。SRM2366可用于評價單位體積中擴增的CMV基因組拷貝的數量（copies/ml）。

CMV可以通過外周血單個核細胞（以及其他臨床標本）進行培養。但是，分離非常費力，須耗時14 d；使用小瓶培養技術（shell vial assay）可以將等待時間縮短到1～2 d。除了周轉時間長外，基于培養的檢查敏感性也較差。因為病毒載量典型情況下很高，而且新生兒會從尿液排出CMV，所以尿液CMV培養在一些機構一直被用于先天性CMV感染的診斷。

通過免疫組織化學或原位雜交檢測，CMV抗原可以在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織標本中顯示。用NAATs檢測多種臨床標本中的CMV DNA，有助于診斷CMV感染。

表2 CMV實驗室檢查Table 2 Laboratory diagnosis of CMV

免疫功能受損宿主感染CMV時，有對抗病毒藥物產生耐藥的潛在可能。一系列檢查可以用于評估抗病毒藥物的耐藥性。最常用的檢查是UL97（磷酸轉移酶基因）測序，伴或不伴UL54（DNA聚合酶）測序。基于序列的檢查可以通過臨床標本DNA擴增進行，前提是標本含有足夠量的CMVDNA。替代方式是，病毒可以首先通過細胞培養分離。更昔洛韋耐藥多是由于UL97的點突變或缺失（膦甲酸鈉、西多福韋不受影響）所致，最常見的是3個密碼子（460、594、595）的突變。UL54點突變或缺失的發生較少見。如果更昔洛韋或西多福韋選擇出了UL54突變，則會出現典型的對更昔洛韋和西多福韋的交叉耐藥，但膦甲酸鈉不受影響。如果膦甲酸鈉選擇出突變，通常不會出現對更昔洛韋和西多福韋的交叉耐藥。

對疑似CMV中樞神經系統感染的患者，可以用NAATs檢測CSF中的CMVDNA。不過，可能出現假陽性的結果（如細菌性腦膜炎患者的CMV DNA可穿過發炎的血腦屏障污染CSF）。CSF抗體檢查可能意味著中樞神經系統感染、血液污染以及抗體穿過血腦屏障。CSF/血清抗體指數的計算可能會有意義。

1.2.3 單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）感染存在HSV 1或2型糖蛋白G抗原特異性的IgG抗體，就意味著既往相應型別病毒的暴露。IgG陽性結果不能區分過去和現在的活動性感染，除非配對的急性期和恢復期標本檢查顯示有血清學轉換。IgG水平升高4倍也提示近期暴露，不過，很多商品化試劑盒不能報告用于定量的滴度結果。存在HSV IgM抗體提示該病毒近期原發性感染。

對HSV相關皮膚或黏膜病變而言，NAATs是最敏感、最特異和最快速的檢查，并可以區分HSV 1和2型（表3）。用病毒培養轉運拭子用力擦拭疑似病變的皮膚和黏膜的基底部，水皰被連根去除后暴露基底。舊的、干的和結痂的病變不太可能產生陽性結果。培養和直接熒光抗體檢查的敏感性低于NAATs。

表3 HSV實驗室診斷Table 3 Laboratory diagnosis of HSV

CSF標本HSVNAATs檢查，可以用于診斷HSV相關中樞神經系統疾病。該方法可以區分HSV 1和2型，1型最常與腦炎有關，而2型最常與腦膜炎有關。CSF病毒培養對HSV相關中樞神經系統疾病而言不夠敏感。

1.2.4 麻疹病毒感染對麻疹產生免疫的個體，會產生針對病毒IgG抗體的陽性結果。未產生免疫的個體，IgG和IgM結果陰性。IgM抗體陽性而無IgG抗體，提示近期有麻疹病毒感染。出疹當天IgM通常是陽性。然而，在出疹后最初72 h內，多達20%的IgM檢查可能是假陰性。因此，如果急性期IgM陰性，出疹72 h后應該采集第2份血清標本檢測IgM。在出疹后1個月或更長的時間里可檢測到IgM。近期接種麻疹病毒疫苗個體的IgM也可能是陽性。血清學診斷急性麻疹時需要有IgG抗體升高4倍（表4）。采集2份血清標本，第1份標本在出疹開始時盡早采集，第2份在10～30 d后采集。2份標本應采用相同的方法在當時就進行檢測。確定滴度升高的標準因所用特異性試劑盒的不同而有所差別。

CSF中麻疹特異性抗體的檢測可用于亞急性硬化性全腦炎（subacute sclerosing panencephalitis, SSPE）的診斷。SSPE患者CSF中麻疹抗體水平升高顯著。

表4 麻疹病毒實驗室診斷Table 4 Laboratory diagnosis ofmeasles virus

麻疹病毒可分離自喉部、鼻咽部或尿液中。出疹后應立即采集標本。NAATs也可考慮作為診斷試驗。

1.2.5 腮腺炎病毒感染幾種類型的檢查可用于腮腺炎診斷（表5）。腮腺炎診斷的實驗室標準包括腮腺炎病毒IgM抗體血清學檢查陽性、急性期和恢復期配對血清IgG抗體水平4倍升高、臨床標本分離到腮腺炎病毒或臨床標本檢測到腮腺炎病毒RNA。

表5 腮腺炎病毒實驗室診斷Table 5 Laboratory diagnosis ofmum ps virus

急性期IgG檢查的血清應在癥狀出現后5 d內采集（即診斷的時候）；恢復期血清應在癥狀出現后大約2周采集。IgM抗體典型情況下在疾病最開始的幾天內可檢測到，起病1周后達到高峰。應用單劑或多劑腮腺炎病毒疫苗會導致缺失的、延遲的或暫時的IgM反應。如果急性期IgM陰性，應在癥狀出現后2～3周采集第2份標本進行IgM檢查。

對既往有免疫的疑似患者，腮腺炎病毒檢查尤其是確診病例的重要方法。病毒分離的首選標本是采自腮腺管的拭子，或采自受累的唾液腺管的拭子。腮腺炎病毒可以通過分子技術（未經美國國家食品藥品監督管理局批準）檢測。從腮腺炎癥狀出現前一直到癥狀出現后5～9 d，都可以檢測到腮腺炎病毒RNA。

CSF抗體檢查提示中樞神經系統感染、血液污染或抗體穿過血腦屏障。CSF/血清抗體指數的計算可能會有意義。

1.2.6 登革熱病毒感染登革熱是蚊子傳播的發熱性疾病。對來自特定地區的旅游者，鑒別診斷時除考慮瘧疾外，還要考慮基孔肯雅病和黃熱病。登革熱診斷需要實驗室確證，方法包括培養、NAATs或登革熱特異性抗體檢測（表6）。血清學檢查是診斷登革熱病毒感染最常見的方法。應在發熱開始后5 d內采集急性期血清標本。登革熱病毒感染早期階段可能檢測不到IgG抗體；IgG抗體一般情況下在癥狀出現后至少6 d才能產生。登革熱病毒的IgG抗體可以持續幾十年。對高度疑似登革熱的患者，如果報告了陰性的檢查結果，應在疾病開始后7～10 d再采集第2份血清標本，檢測IgM和IgG抗體。登革熱病毒IgM的檢出提示近期感染，不過登革熱病毒IgG血清學轉換也可用于確診感染。抗登革熱病毒抗體檢查可能會檢測到針對其他黃病毒的抗體，包括西尼羅病毒和圣路易斯腦炎病毒。應特殊要求，美國國家疾病預防控制中心實驗室和部分參考實驗室可以進行登革熱病毒分子檢測。

表6 登革熱病毒實驗室檢查Table 6 Laboratory diagnosis of dengue virus

1.2.7 腺病毒感染對無其他疾病的健康個體而言，腺病毒通常引起輕度、自限性呼吸系統疾病，多數病例僅僅通過臨床資料就可進行診斷。少數情況下，宿主腺病毒感染可以致免疫功能正常尤其是患有哮喘病的兒童死亡。免疫功能受損的宿主中，腺病毒可以導致肺炎、播散性感染、胃腸炎、出血性膀胱炎、腦膜腦炎和肝炎等。

診斷可基于NAATs、培養和（或）適合的組織病理學檢查（表7）。病毒培養周期長，使用小瓶培養技術會縮短時間。血漿病毒載量（通過定量NAATs評估）可用作搶先治療的標志物，用于診斷腺病毒相關癥狀體征，還可用于監測一些免疫功能受損人群的抗病毒治療反應。

血清學檢查有賴于檢測出針對群特異性抗原的抗體，通常須要分析急性期和恢復期的血清。中樞神經系統感染的血清學診斷基于CSF/血清抗體指數、急性期和恢復期IgG滴度4倍升高或僅IgM陽性。CSF中檢測到抗體可能意味著中樞神經系統感染、血液污染或抗體穿過血腦屏障。

表7 腺病毒實驗室診斷Table 7 Laboratory diagnosis of adenovirus

2 討論

隨著免疫力低下人群的增多，病毒感染性疾病在增加。EBV是免疫抑制患者單核細胞增多癥和淋巴細胞增殖性疾病的病因；在免疫功能受損、造血干細胞和器官移植者中應警惕CMV感染，當免疫功能受損宿主感染CMV時，有對抗病毒藥物產生耐藥的潛在可能；HSV是人類感染比例最高的病毒之一，而且是病毒性腦炎的首位致病原因；麻疹病毒在中樞神經系統的感染涉及SSPE，其預后不良；近年來國際上因麻風腮疫苗不良反應問題，腮腺炎病毒成為關注熱點；登革熱病毒感染是熱帶亞熱帶地區經蚊傳播的發熱性疾病，感染嚴重者預后不良；腺病毒的重癥感染預后不良，目前對該病毒的了解還遠不夠深入。臨床診斷和治療的關鍵依賴實驗室檢查，病毒培養、血清學檢測及分子生物學檢測均受多種因素影響，本指南對各種病毒感染性疾病的檢測方法選擇、標本及其運輸、貯存條件給予指導，希望臨床與實驗室密切配合、規范操作，不斷提高病毒感染性疾病的診治能力。

[1]Baron EJ,Miller JM,Weinstein MP,etal.A guide to utilization of the microbiology laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013 recommendations by the Infectious Diseases Society of America(IDSA)and the American Society for Microbiology(ASM)［J］. Clin Infect Dis,2013,57(4):e22-e121.

（2013-12-04收稿 2014-01-02修回）

（責任編委 曲芬 本文編輯 王姝）

A brief introduction to a guide to utilization of them icrobiology laboratory for diagnosis of infectious diseases(2013):some viral syndromes

NING Yong-zhong
Laboratory Department,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

This article focuses on themicrobiology laboratory diagnosis of some viral syndromesmentioned in a guide to utilization of themicrobiology laboratory for diagnosis of infectious diseases:2013 recommendations by the Infectious Diseases Society of America and the American Society for Microbiology.

microbiology;laboratory;communicable diseases;guidebooks

R37；R51

A

1007-8134(2014)01-0013-05

100191，北京大學第三醫院檢驗科（寧永忠）