MLPA在診斷1例復雜性先天性心臟病中的應用

譚衛荷 佘 芹 郭曉燕 李付廣 張金云 湯素環

（廣東省清遠市人民醫院，廣東 清遠 515500）

MLPA在診斷1例復雜性先天性心臟病中的應用

譚衛荷 佘 芹 郭曉燕 李付廣 張金云 湯素環

（廣東省清遠市人民醫院，廣東 清遠 515500）

目的采用多重連接探針擴增技術（MLPA）對臍帶血標本進行進行檢測，分析在復雜性先天性心臟病診斷中應用的診斷價值。方法①對1例復雜性先天性心臟異常胎兒取臍帶血3 mL臍帶血細胞進行培養和標本制作，利用G顯帶技術對染色體核進行分析；②并取200 μL提取DNA后采用MLPA技術進行檢測。結果G顯帶染色體核型分析46，XY，MLPA 檢測結果為與先天性心臟病相關的2個探針對應的片段大小位置在3100的電泳圖上熒光峰值相比正常對照明顯出現減半，統計缺失區域的熒光比值為0.450和0.339（正常值：0.7～1.3）。結論患兒在與先天性心臟病相關的基因位點（GATA4）的上游存在雜合性缺失，缺失的片段大小約為1.5kb。

復雜性先天性心臟?。欢嘀剡B接探針擴增

先天性心臟病是一種多基因遺傳病，所涉及的基因在表達質或量上的異常都可能影響心臟發育，導致先天性心臟病的發生。本文對1例復雜性先天性心臟異常兒取臍帶血，對臍帶血細胞進行培養染色體核型分析，同時提取DNA后采用MLPA技術進行檢測。

1 資料與方法

1.1 研究對象

龔紅麗之子，2011年03月25日順產出生，出生時宮內妊娠40+1周，羊水清，無窒息，阿氏評分10-10-10分，體質量2600g，輕微唇裂，尿道閉鎖，肛門無異常，余外觀未見異常，心臟聽診無明顯雜音，出生前B超提示單心房，單心室。出生后新生兒行心臟彩超檢查，診斷：單心房，單心室，二尖瓣閉鎖，永存動脈干，動脈導管未閉，輕度三尖瓣關閉不全，以上資料的獲得均經患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析

按常規方法抽取3 mL臍帶血細胞進行培養和標本制作，利用G顯帶技術對染色體核型進行分析，根據《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）（2005）》描述染色體核型。

1.2.2 MLPA分析

①基因組DNA的提?。喝√耗殠а?00 μL，采用QIAamp DNA Mini Kit （Qiagen），嚴格按照規定提取DNA，并測定其在260 nm和 280 nm處的吸光度值，再計算出DNA的純度與濃度，要求A260/A280在1.8～2.0。最后使用TE緩沖液（pH=8）把DNA稀釋到100 ng/μL。②MLPA檢測：選用荷蘭MRC Holland公司MLPA Mental Retardation-1試劑盒（SALSA P311；MRC-Holland）中31個與先天性心臟病相關區域的探針（序列見P311說明書）。MLPA操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，取100 ng的基因組DNA，在95 ℃的環境中存放5分鐘，后取出與SALSA探針P311均勻混合，再置于95 ℃的環境中1 min，然后將溫度調至60 ℃雜交16 h，在54 ℃的環境中使用連接酶連接15 min后，在98 ℃孵育5 min后停止反應，并使用SALSA FAM PCR體系使PCR得到擴增。在PCR產物中選取1 μL樣品，采用測序儀對其進行片段分析，并使用正常人的標本與每次反應對照，使用GeneMarker 1.71軟件處理得到的結果，計算片段擴增或缺失的情況。MRC-Holland 定義探針正常比值范圍為0.7～1.3。

2 結 果

圖1 患兒MLPA篩查結果。藍色點代表內參探針，綠色點與紅色點代表與先天性心臟病相關的探針（紅色點為異常），如圖示探針長度在229，362nt位置探針峰值比明顯降低

圖2 患兒MLPA篩查結果。藍色峰代表樣本，紅色峰代表正常對照，顯示探針長度在229，362nt位置探針峰值明顯降低

2.1 G顯帶染色體核型分析

染色體G顯帶核型分析46，XY。

2.2 MLPA檢測結果

本研究病例的MLPA驗證結果，與先天性心臟病相關的2個探針對應的片段大小位置在3100的電泳圖上熒光峰值相比正常對照明顯出現減半，統計缺失區域的熒光比值為0.450和0.339（正常值：0.7～1.3），根據診斷標準，可判斷患兒在與先天性心臟病相關的基因位點（GATA4）的上游存在雜合性缺失，缺失的片段大小約為1.5kb。見圖1和圖2。

3 討 論

先天性心臟病是一類胚胎期心血管系統發育異常所引起的先天畸形，在出生后存活嬰兒中的發生率為0.3%～1.0%，在流產兒和死胎中則高達10.2%[1]。是一種多基因遺傳病，主要是由于胚胎期遺傳因素和環境因素共同作用導致心臟血管異常發育所引起的。

研究報道，GATA4是與心臟發育密切相關的一種特定細胞核轉錄因子，它在心臟前體細胞分化、心臟發育、心肌肥厚和抗凋亡等方面發揮著重要的調節作用[2]，GATA4基因突變可引起心臟異常發育，若GATA4的功能減弱，內胚層細胞不會正常分化，則導致心臟發生異常。GATA4基因突變的致病機制可能包括轉錄因子對靶DNA 結合親和力下降、下游靶基因的轉錄活性降低或其他輔因子相互作用缺失[3-4]。本病例的MLPA驗證結果，與先天性心臟病相關的2個探針對應的片段大小位置在3100的電泳圖上熒光峰值相比正常對照明顯出現減半，見圖1，統計缺失區域的熒光比值為0.450和0.339（正常值：0.7～1.3），根據診斷標準，可判斷患兒在與先天性心臟病相關的基因位點（GATA4）的上游存在雜合性缺失，缺失的片段大小約為1.5kb。由于基因片段缺失，導致單心房，單心室，二尖瓣閉鎖，永存動脈干，動脈導管未閉，輕度三尖瓣關閉不全，結果表明GATA4基因異常是導致心臟發育異常的主要原因。

[1] 徐小延,邱廣蓉,宮立國,等.GATA4基因與單純性先天性心臟病的相關性研究[J].中國實用兒科雜志,2007,22(8):587-590.

[2] 陳名武,劉唐威,龐蓋生.轉錄因子GATA4在心血管系統中作用的研究進展[J].中華心血管雜志,2008,36(1):44-45.

[3] Xin M,Davis CA,Molkentin JD,et a1.A threshold of GA7 4 and GATA6 expression is required for cardiovascular development[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(30):11189-11194.

[4] Schluterman MK,Krysiak AE,Kathiriya IS,et a1. Screening and biochemical analysis of GA 4 sequence variations identified in patients with congenital heart disease[J].Am J Med Genet A,2007, 143A(8):817-823.

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1671-8194（2014）13-0316-02