SD大鼠骨髓間充質干細胞的分離及5-氮胞苷對其的誘導分化作用

鄧麗群 沈法榮 金紅峰 王歡

SD大鼠骨髓間充質干細胞的分離及5-氮胞苷對其的誘導分化作用

鄧麗群 沈法榮 金紅峰 王歡

目的 探討SD大鼠骨髓間充質干細胞（SD-MSCs）體外分離的方法條件、生物學特性及5-氮胞苷對其的誘導分化作用。 方法 采用全骨髓貼壁法分離培養SD-MSCs，進行形態學觀察，繪制生長曲線，流式細胞儀對其細胞周期進行分析，并通過成脂肪誘導鑒定，給予5-氮胞苷進行誘導分化，通過免疫組化和蛋白免疫印跡法,觀察其對超極化激活環核苷酸門控的通道蛋白(HCN2）表達情況。 結果 SD-MSCs以長梭形和多角形為主，呈放射狀集落生長，細胞生長曲線呈S形，增殖能力比較活躍。成脂肪誘導后，細胞胞質內有大量橙紅色脂滴形成。不同濃度的5-氮胞苷對SD-MSCs進行誘導分化后，7.5、10、12.5μmol/L5-氮胞苷誘導的HCN2表達陽性強度較高，其中10μmol/L的5-氮胞苷誘導24h的SD-MSCs HCN2表達強度最高。 結論 全骨髓貼壁法能夠有效分離純化增殖SD-MSCs，5-氮胞苷能夠誘導其分化為HCN2表達陽性的細胞。

骨髓間充質干細胞 全骨髓貼壁法 5-氮胞苷

骨髓間充質干細胞（MSCs）是一類存在于骨髓中的干細胞，它不僅可以為造血干細胞（HSC）提供基質環境促進HSC增殖，而且也可以在體內外適當的刺激下誘導分化成不同類型的細胞[1]。5-氮胞苷可以降低細胞DNA的甲基化水平，進而與MSCs向心肌細胞分化的特異啟動基因上的阻遏蛋白相結合[2]，有可能將MSCs定向分化，甚至有可能分化為具有起搏功能的細胞，從而實現生物起搏的功能。起搏細胞膜上存在一種超極化激活環核苷酸門控的通道蛋白（HCN），其中的HCN2是細胞是否具有起搏功能的一個重要的標志。因此探尋5-氮胞苷能否誘導分化具有起搏細胞特性的細胞意義非常重要。本研究旨在探討5-氮胞苷能否定向誘導MSCs分化為HCN2陽性的細胞及其相關的轉化條件，為接下來的實驗奠定一定基礎。

1 對象和方法

1.1 實驗動物和試劑 清潔級4周齡雄性SD大鼠6只，體重約100g，由浙江省醫科院提供。低糖DMEM細胞培養基、100U/ml青霉素、鏈霉素及0.25%胰酶-0.02%EDTA混合液（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司）、胎牛血清（南美洲Gibco公司），細胞周期即時檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司），成骨成脂肪誘導分化培養液（廣州賽業生物科技有限公司），5-氮胞苷（美國Selleckchem公司），HCN2抗體（美國Proteintech公司）等。

1.2 方法

1.2.1 SD-MSCs的原代提取分離培養 用10%水合氯醛0.3～0.4ml/100g大鼠腹腔注射麻醉，用75%乙醇浸泡5～10min消毒后，無菌條件下剪開兩側后肢皮膚及肌肉，取股骨浸泡在裝有含青霉素、鏈霉素雙抗的細胞生理鹽水（PBS）中。75%乙醇消毒離心管，除去骨表面的肌肉筋膜，放入裝有事先配置好的含血清10%的DMEM的6cm培養皿中，將股骨剪斷，暴露骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5ml的細胞培養液，針頭插入骨髓腔內，沖洗數次，并將其反復在培養皿中吹吸細胞懸液3～5次，再過濾到另一個無菌皿中，將過濾過的細胞懸液移至10ml離心管中，1 000r/min離心5min，棄上清液，用10%的DMEM將細胞吹散移至6cm培養皿內配至約5ml，置于飽和溫度37℃、pH 7.2，5%CO2恒溫培養箱，48h首次更換細胞生長液，以后3～4d更換1次。

1.2.2 SD-MSCs的純化增殖 原代培養約7～10d，待融合至這個培養皿的80%左右，開始傳代，傳代前用不含血清的DMEM輕輕沖洗1～2遍后，加入事先37℃預熱的含0.25%胰酶-0.02%EDTA混合液1ml，1～2min后，倒置顯微鏡下觀察到細胞回縮變亮后，吸出上清液，加入含血清10%的DMEM終止消化，用槍頭輕輕吹打培養皿至細胞變為懸浮狀態，按1∶2或1∶3傳代（P1），傳代后2d細胞便可貼壁，3～5d便可繼續傳代，即可依次得到P2、P3。

1.2.3 SD-MSCs細胞生長曲線 分別取上述生長穩定的第4天的P2、P3細胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA混合液消化后，計數板計數，用含血清10%的DMEM稀釋細胞計數板計數獲得1×104個/ml左右的細胞，接種于24孔板每孔1ml，每天取3孔計數取平均值，連續8d。以培養時間為橫軸，細胞計數為縱軸，建立坐標系，描繪生長曲線。

1.2.4 細胞周期檢測 收集培養穩定的P2代細胞，1 500r/min離心5min，棄去上清液，PBS清洗1～2次，保留100μl，保證細胞數量＞2×105，取50μl加入試管底部，加入100μl 4℃預冷的乙醇，與細胞懸液輕輕混勻，盡量避免產生氣泡，室溫孵育10min固定單個細胞；加入RnaseA100μl，輕輕混勻，盡量避免產生氣泡，室溫孵育10min溶解細胞膜脂質；加入150μl碘化吡啶室溫孵育15min避光染色，流式細胞儀分析結果。

1.2.5 成脂肪誘導 取SD-MSCs P2代生長良好的細胞，接種于事先1%明膠包被好的6孔板2個孔中（1號孔為A對照組，2號孔為B實驗誘導組），每孔細胞數約為104個，置入培養箱過夜，待細胞貼壁＞50%，2號加入成脂肪誘導培養液，成脂肪誘導培養液A、B交替使用，每周更換2次，每次換液時倒置顯微鏡下觀察細胞形態，1號孔每3d換1次含血清10%的DMEM，約3周后對成脂肪誘導的細胞行油紅O染色并倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6 5-氮胞苷對SD-MSCs P2細胞的誘導 6孔板中分別采用濃度為0、5、7.5、10、12.5、15μmol/L的5-氮胞苷的培養液，培養24h換液，換液后繼續培養2周后做免疫組化及蛋白免疫印跡試驗，一抗選用HCN2，觀察分析結果，結果示10 μmol/L的5-氮胞苷的培養液陽性結果最高。取SD-MSCs P2細胞置入5個6cm培養皿中，均予以10μmol/L的5-氮胞苷的培養液培養24h換液，然后分別于換液后第1、3、7、10、14天，細胞提蛋白，第15天做蛋白免疫印跡試驗，一抗選用HCN2，對免疫印跡條帶通過OD比值觀察分析其HCN2表達情況。

2 結果

2.1 SD-MSCs的原代提取分離培養結果 圖1（見插頁）。

圖1 培養過程中不同時間SD-MSCs的形態（A：原代培養5d；B：P1培養3d；C：P2培養3d；D：P3培養3 d；×100）

由圖1可見，原代細胞培養24h后可見部分細胞貼壁，2～3d后貼壁細胞明顯增多,逐漸伸展成為長梭形、多角形，伸出長短不一，未貼壁的細胞在換液時被除去。在原代培養中，細胞貼壁生長是以分散的、克隆集落方式增殖。7～10d，相鄰集落融合成片達80%以上，可按1∶2或者1∶3傳代，傳代之前可以用不含血清的培養液沖洗去掉未貼壁的細胞，傳代后即得P1細胞。傳代培養的細胞于4～6h開始貼壁，24h內完全貼壁，形態與原代細胞相似，但增殖速度明顯增快,生長5～7d即融合達80%以上，方可傳代，依次得到P2、P3，細胞形態開始呈比較，均一的長梭形漩渦狀生長。

2.2 細胞生長曲線 見圖2。

圖2 P2、P3 SD-MSCs的生長曲線

由圖2可見，傳代后第1～2天細胞數目減少（潛伏適應期），3～5d細胞開始大量增加（對數增長期），第6～7天增幅緩慢趨于穩定（平臺期），未出現衰老。

2.3 SD-MSCs的細胞周期結果 見圖3。

圖3 P2 SD-MSCs的生長周期

由圖3可見，SD-MSCs 78.87%處在G1期，5.46%處在S期，3.96%處在G2期，表明SD-MSCs有較強的增殖能力，增殖周期約為5d。

2.4 成脂肪誘導結果 圖4（見插頁）。

由圖4可見，細胞形態由長梭形變為圓形或橢圓形，約3周后油紅O染色，胞質內出現大量橙紅色折光性強的脂滴，大小不一，多呈圓形，部分脂滴相互融合；對照的未誘導組染色后未見紅染脂滴。

2.5 5-氮胞苷對SD-MSCs P2細胞的誘導結果 圖5、6（見插頁）。

圖5 免疫組化結果圖（A：未用5-氮胞苷誘導培養2周的SD-MSCs；B～F分別為5、7.5、10、12.5、15μmol/L的5-氮胞苷誘導24h后繼續培養2周的SD-MSCs；×100）

圖6 免疫印跡條帶（A：濃度分別為0、5、7.5、10、12.5、15μmol/L的5-氮胞苷誘導24h后，繼續培養2周后的HCN2免疫印跡結果；B：A對應的β-actin免疫印跡結果；C：10μmol/L的5-氮胞苷誘導24h后，第1、2、7、10、14天的HCN2免疫印跡結果；D：C對應的β-actin免疫印跡結果）。

由圖5可見，藥物誘導2周后用7.5、10、12.5μmol/ L5-氮胞苷誘導的細胞有黃染，其中10μmol/L的細胞黃染最深。圖6A、B灰度分析的OD比值示，在5-氮胞苷的濃度為0、5、7.5、10、12.5、15μmol/L時，所對應的OD值分別 為 0.033、0.062、0.155、0.626、0.282、0.074；圖6C、D灰度分析的OD比值示，10μmol/L的5-氮胞苷誘導24h后，第1、2、7、10、14天的OD值分別為0.449、1.333、3.019、4.976、5.811。通過分析可以發現7.5、10、12.5μmol/L5-氮胞苷誘導的HCN2表達陽性較強，其中10μmol/L的5-氮胞苷誘導24h的SD-MSCs HCN2表達最強。對10μmol/L的5-氮胞苷誘導24h的SD-MSCs HCN2表達跟蹤培養15d，發現隨培養時間的延長陽性表達越強。

3 討論

MSCs自我復制能力強，具有高度的增殖能力，體外基因轉染率高及多向分化潛能等諸多優點[3]。基于它特有高度自我更新及潛在的多向分化的屬性，成為基因治療和細胞治療的首選靶細胞[4]。全骨髓貼壁法是目前國內采用分離MSC的較為普遍方法[5]。在整個實驗過程中,要獲得活性好、形態均一穩定的MSCs還應注意嚴格的無菌操作,在提取原代的過程中尤為注意，必要時應在培養基內添加抗生素。L-谷氨酰胺在細胞培養中起重要作用，脫氨基后，L-谷氨酰胺可作為細胞培養的能量來源、參與蛋白質的合成以及核酸代謝，谷氨酰胺缺乏有可能導致細胞生長不良甚至死亡。因而L-谷氨酰胺的外源性添加很重要，是干擾細胞生長周期及倍增時間的重要影響因素，在間充質干細胞分裂中起重要作用[6]。培養液開封后若在4℃儲存超過2周時,應注意添加L-谷氨酰胺溶液,否則會出現細胞生長不良和死亡現象。

目前尚未發現特異的抗原表型，可以用于直接鑒定MSCs[7]，間接通過細胞形態學的觀察、生長周期及曲線、表面標志以及多向分化等特點逆向推斷是否為MSCs[8]。地塞米松、吲哚美辛及異丁基甲基黃嘌呤等成脂肪誘導劑在體外對MSCs的作用，可以誘導分化形成脂肪細胞[9]。我們通過繪制生長曲線，流式細胞儀對其細胞周期進行分析，并通過成骨成脂肪誘導鑒定其為MSCs。

5-氮胞苷是胞嘧啶核苷酸的一個類似物，具有良好的誘導分化的能力，不過對分化為不同的細胞，誘導條件是不同的。5-氮胞苷可能可以降低細胞DNA的甲基化水平，進而與MSCs向心肌細胞分化的特異啟動基因上的阻遏蛋白相結合，使后者去甲基化而發生構型變化，使其向心肌細胞分化[2，10]。5-氮胞苷能夠有效誘導MSCs分化為心肌樣細胞，表達ɑ-肌動蛋白、肌鈣蛋白T、肌間線蛋白和β-肌球蛋白[11]。

研究表明，HCN基因表達控制Na+，K+，Ga2+通道，竇房結細胞的自律性是由于其舒張期動作電位4期能夠自動除極化引起的，這個過程主要由超級化激活內向陽離子流（If）來完成。Plotnikov等[12]將轉染了 HCN2的人MSCs注入到完全房室傳導阻滯的狗左心室前壁，實驗期間左心室心率明顯加快，轉染的人MSCs與周圍心肌組織建立縫隙連接，說明了HCN2的重要性。因此本實驗通過5-氮胞苷誘導的SD-MSCs細胞能夠表達HCN2陽性的細胞，為下一步的研究打下了基礎。

因此我們認為利用全骨髓貼壁法提取的SD-MSCs，并通過形態學觀察，繪制生長曲線，流式細胞儀對其細胞周期進行分析，并通過成脂肪誘導鑒定所提取的細胞為SD-MSCs。通過用10μmol/L的5-氮胞苷對SD-MSCs誘導24h后繼續培養，發現其對HCN2的表達為陽性，說明其可能分化為具有起搏細胞功能的起搏樣細胞可能，不過仍然需要進一步的研究來證實其是否具有起搏功能，如進行膜片鉗實驗來進行起搏電流的測定等。

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Induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells by 5-azacytidine

DENG Liqun,SHEN Farong，JIN Hongfeng，et al.
the Second Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China

Mesenchymal stem cells The whole bone marrow adherence culture 5-azacytidine

2013-11-24）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省高層次創新人才培養項目（02099）

310053 杭州，浙江中醫藥大學第二臨床醫學院（鄧麗群）；浙江綠城心血管病醫院（沈法榮）；浙江醫院（金紅峰、王歡）

沈法榮，E-mail：shenfarong2011@163.com

【 Abstract】 Objective To induce rat bone marrow mesenchymal stem cells(SD-MSCs)with 5-azacytidine(5-aza). Methods The primary culture of SD-MSCs was isolated from the bone marrow of SD-rats by the whole bone marrow adhesion separation.The morphology ofSD-MSCs was observed with phase contrast microscopy.The cellcycle was analyzed by flow cytometry.The multilineage differentiation capability of SD-MSCs was examined by adipogenic differentiation method.SD-MSCs was induced by 5-aza,and the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel(HCN2)in induced SD-MSCs was examined by immunohistochemistry and Western blot.Results Through isolation and culture,SD-MSCs developed a spindle appearance and had radiated colony growth.Growth curve of SD-MSCs presented S shape.SD-MSCs kept a high potential of multiplication.After adipogenic differentiation,lipid droplets presented red under oil red O staining.Immunohistochemistry and Western blot showed that SD-MSCs expressed positive for HCN2after induced by 5-aza. Conclusion SD-MSCs can be separated,proliferated and purified under the whole bone marrow adherence culture and 5-aza can successfully induce differentiation ofSD-MSCs.