食用油脂抗氧化劑TBHQ在高效液相色譜法檢測中的研究

摘要：通過簡單萃取，加入抗壞血酸棕櫚酸鹽（AP）作保護劑，能夠在高效液相色譜上獲得較好的TBHQ標準曲線、回收率，從而改進國標檢測方法和環境，得到更高的精密度和更低的檢出限。

關鍵詞：TBHQ；檢測；高效液相色譜

自古至今，食品就是人類賴以生存、繁衍、維持健康的基本條件。食品安全問題是政府、社會以及消費者高度關注的重要領域，食品添加劑的出現為食品工業帶來了新的轉機，產品種類的多樣化，產品質量的提升，保存期限的延長都為食品工業的發展注入了強大的活力。針對食品中食品添加劑建立準確快速的的色譜檢驗方法，無疑具有十分重要的意義。不論還是食品添加劑以及其它有害成分都需要建立可靠、有效、準確的檢測方法。

一、分析對象

TBHQ （特丁基對苯二酚）是一種親油性抗氧化劑，因其抗氧化性能好，能阻止或延遲油脂氧化變質，廣泛用于食用油脂，目前已在全世界多個國家使用。各國對TBHQ的使用都有嚴格的限量規定，而在日本，TBHQ尚未批準作為油脂抗氧化劑，并以此作為一種技術壁壘手段，要求方法檢出限值達到1 mg/kg。我國對油脂及其制品中抗氧化劑TBHQ的測定有薄層法、比色法、氣相色譜法和高效液相色譜法等，但這些方法檢出限值均不足以適應油脂制品出口新形勢的需要，也有報道采用GC/MS測定TBHQ檢出限可在1mg/kg以下，但方法樣品前處理復雜，且儀器昂貴不便于推廣。本實驗對采用高效液相色譜 熒光檢測法測定TBHQ進行了研究，檢出限大大降低而靈敏度顯著提高。GB/T5009.30-2003介紹了TBHQ的檢測方法，但方法用起來十分復雜，不僅步驟繁瑣，而且效果很差，首先層析柱如何裝填就是一個問題。按照方法，需使用者自行裝填層析柱，而手工裝填的層析柱松緊不一，很難控制質量。填的松了怕吸附不夠，填的緊了淋洗速度奇慢，1小時也滴不出幾滴，一個樣品可能要淋洗幾天。

二、 實驗部分

（一）儀器與試劑 日本島津HPLC高效液相色譜儀及控制器，配有熒光檢測器（RF-20）；旋轉蒸發儀；溶劑過濾器。TBHQ標準品（美國 Fluka，g98.5%）；L抗壞血酸棕櫚酸鹽；甲醇、乙腈，正己烷等化學試劑均為色譜純，水為去離子水。

（二）色譜分析條件

色譜柱：C18（250L×4.6mm）；流動相：V（0.02mol/L磷酸）∶V（甲醇）∶V（乙腈）=6∶2∶2；流速：1.0 mL/min；熒光檢測器最大激發波長293，最大發射波長為332 nm；柱溫：40℃；進樣量：20μL。

（三） 樣品制備

由于油樣的組成相當復雜，與常用的有機試劑多少有一些混溶。甲醇提取液中也會有一小部分的油分，可以加一些水驗證，純甲醇溶液無變化，而油樣的甲醇提取液一加水立刻混濁。

這一小部分的油分對于檢測沒有什么太大影響，但對于色譜柱污染較大。因此在不影響回收率的前題下如何排除油分的影響是該實驗的一個重點。準確稱取色拉油樣品5.0 g（精確至0.01 g）于25 mL燒杯中，用經乙腈飽和的正己烷溶解并轉移至50mL容量瓶中定容，充分混勻，然后用經正己烷飽和的乙腈提取3次，每次50 mL，合并乙腈提取液于濃縮瓶中，在40℃下，用旋轉蒸發儀濃縮至1～2 mL，最后將濃縮液轉移至刻度管中并用乙腈定容至5 mL，經0 45 mm濾膜過濾后供高效液相色譜分析。

如果對人身防護很看重，可以用乙醇代替甲醇，但它與油分的互溶程度大些，提取液似乎沒有那么\"干凈\"。當處理某些輕質油如代可可脂時，會有完全混溶現象，這時只能用甲醇。

（四）標準曲線的繪制

準確稱取THBQ標準品100 mg于容量瓶中，用乙腈溶解并準確定容至100 mL，制成TBHQ標準溶液儲備液（濃度為1.0g/L）。用乙腈將儲備液稀釋成0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/L的系列標準使用溶液，分別進行高效液相色譜分析，制作標準工作曲線。

三、結果與討論

（一） 色譜條件的選擇 高效液相色譜法檢測食用油脂中TBHQ，可使用紫外檢測器（VWD）、二極管陣列檢測器（DAD）和熒光檢測器（FLD）等。本研究選擇VWD、FLD兩種檢測器進行了比較實驗，其結果顯示，FLD的靈敏度明顯高于VWD的靈敏度。分別固定激發波長或發射波長進行掃描，確定TBHQ的波長為293 nm。柱溫選擇40℃，色譜柱內徑為4.6 mm，流速為1.0 mL/min。實驗表明，在恒溶劑組成的條件下，流動相為V（0.02mol/L磷酸）∶V（甲醇）∶V（乙腈）=6∶2∶2的配比可使TBHQ在10 min內出峰，且不受雜質峰的影響，大大縮短了分析時間，避免了梯度分析時間較長的缺點。

（二）樣品處理方法的優化

在樣品處理時，在乙腈中加入抗壞血酸棕櫚酸鹽（AP）作保護劑。標準加入回收實驗發現，同樣在添加水平分別為0.1、0.5和1.0 mg/g的情況下，加入AP回收率可達到90%以上，而不加AP則回收結果未檢出，說明測試對象極易在測試環境下氧化。因此，在低濃度的情況下，該保護劑可有效防止試樣中的TBHQ在處理過程中被氧化，保證了方法的檢出限與回收率。

（三）標準曲線和檢出限在2.2色譜條件下進樣10mL，以TBHQ濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，回歸方程為Y=242.1489X+12.9095，r=0.9998，說明在0.02～5.0 mg/L范圍內線性關系良好。本方法的最低檢出濃度為0.02mg/L，檢出限為0.1mg/g。

（四）方法回收率、精密度和準確度

在選定的色譜條件下對各種食用植物油樣品進行了測定，同時進行添加回收實驗，3個添加水平分別為：0.1、0.5和1.0mg/g。按照樣品處理方法進行提取凈化，測定TBHQ含量，計算回收率，其平均回收率分別為89.3%、93.1%和91.7%，相應的RSD分別為3.5%、3.1%和2.2%（n=7）。應用本方法測定了油脂樣品約60批，其中TBHQ含量大于1.0 mg/g為2批。該方法具有很高的靈敏度與精密度，重復性好，回收率高，在實際樣品測定中獲得了滿意的結果。此外，在樣品處理過程中添加抗壞血酸棕櫚酸鹽能夠有效降低檢出限。

四、 小結

此方法在日常檢驗中較之國標方法制樣簡單，分析快速，檢出限低，在去年監督抽查中檢測樣品60批次，高級油中可同時檢測BHA、BHT、TBHQ，可通過計算直接獲得抗氧化劑使用比例之和。此方法在各檢驗室使用時略有差異，最佳條件依機器及環境不同而不盡相同。在這里將我實踐結果與大家共享，希望能夠在技術上共同有所提升。