NGAL在腎損傷中的研究進展

孫延慧 王鳳超

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽省蚌埠市 233004

中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（Neutrophil gelatinas assoeiated lipoealin，NGAL）作為新型腎損傷標(biāo)志物成為最近研究的熱點。NGAL是25KD的新型小分子蛋白質(zhì)，1993年Kjeldsen［1］在研究中性粒細胞中MMP－9時發(fā)現(xiàn)的。NGAL具有多種生物功能，參與人體內(nèi)重要的生理、生化過程：疏水性小分子的運輸作用、細胞內(nèi)鐵離子的轉(zhuǎn)運、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等。近年來發(fā)現(xiàn)NGAL在缺血性腎損傷及腎毒性因素所致腎損傷中高表達，動物試驗發(fā)現(xiàn)其可能具有治療作用，因此成為腎臟疾病相關(guān)分子研究的熱點，本文就其研究進展情況進行綜述。

1 NGAL的結(jié)構(gòu)特點

NGAL是由NGAL基因編碼的一種蛋白質(zhì)，編碼基因的全長為5 869bp，其中包括1 695bp的5’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，178bp的3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，其原初轉(zhuǎn)錄區(qū)（Primery transcribed region）是由七個外顯子和六個內(nèi)含子構(gòu)成的3 696bp基因段［2］。配對的cDNA全序列由63bp的5’端非翻譯區(qū)和591bp的編碼區(qū)組成，含有可以編碼197個氨基酸殘基肽鏈的密碼子。NGAL不但可以以單體形式存在，而且還可以以多聚體的形式共存，例如在中性粒細胞的一些特殊顆粒中，NGAL可與金屬蛋白酶（MMP－9）共價結(jié)合，形成1 351KD的異二聚體，在中性粒細胞的另一些特殊顆粒中NGAL與金屬蛋白酶無關(guān)而單獨存在。

2 NGAL的組織分布及功能

近年研究顯示NGAL不但組織分布廣泛，而且可能參與多種重要的生理、生物化學(xué)過程：細胞的分化及凋亡、胚胎的發(fā)育、細胞炎癥反應(yīng)及機體免疫應(yīng)答、脂質(zhì)代謝、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。生理狀態(tài)下，NGAL主要存在于中性粒細胞中過氧化物酶陰性顆粒中，小腸潘氏細胞、腎近曲小管細胞、肝膽管細胞、胃壁細胞等也有少量表達，但在腦及周圍神經(jīng)、心臟等組織細胞中卻呈陰性表達。NGAL以25KDa的單體、45KDa同二聚體及135KDa異二聚體三種不同的分子形式存在于中性粒細胞、血漿及尿液。腎臟上皮細胞主要以單體形式分泌NGAL［3，4］，在 腎 臟 中 性 粒 細 胞 的NGAL則 以 二 聚體的形式釋放［5，6］。鑒于目前NGAL的功能尚未完全明了，根據(jù)目前研究推測其有重要的防御及免疫功能：（1）先天性宿主防御功能，NGAL存在于一些與防御微生物有關(guān)的細胞如小腸的潘氏細胞等，已有研究表明潘氏細胞中NGAL可以抑制微生物的生長，通過與小腸微生物競爭對鐵的吸收作用。它也可以干擾細菌能量代謝，通過結(jié)合細菌分泌的一種鐵離子配合物（扣留鐵離子），這種結(jié)合具有高度的親和力，主要以氫鍵和范德華力維系，形成牢固的NGAL·Fe·Ent三元復(fù)合物［7］，因此NGAL是免疫系統(tǒng)中參與干擾細菌代謝的一個抗菌蛋白；（2）NGAL與T細胞的成熟密切相關(guān)，NGAL在胸腺由上皮細胞構(gòu)成的Hassall’s小體亦高表達，其免疫學(xué)研究價值不可忽略［8］。另有研究發(fā)現(xiàn)NGAL與泌尿道感染有關(guān)，在沒有急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）及泌尿道感染患者的尿液中也發(fā)現(xiàn)了NGAL水平的升高［9，10］，其意義尚不明確。

3 NGAL在診斷早期腎損傷的應(yīng)用

3.1 NGAL與急性腎損傷 腎臟發(fā)育基本特征是間質(zhì)細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)化，這種細胞類型的轉(zhuǎn)變受分泌因子調(diào)節(jié)［11］，NGAL與腎小管發(fā)育及修復(fù)最為緊密，在生理情況下，它可以促進腎臟祖細胞轉(zhuǎn)化為腎小管上皮細胞，使腎臟生長發(fā)育、基本結(jié)構(gòu)得以形成和維持的重要分子，在腎缺血或急性腎毒性損害的病理情況下，高表達于受損的腎小管，NGAL蛋白可以誘導(dǎo)腎小管上皮細胞修復(fù)再生，使腎臟功能得以恢復(fù)。對兒童和成人的心臟術(shù)后前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后2～6h，其血液和尿液中就能檢測到NGAL，其濃度是正常值的10倍以上［12］，尿NGAL上升是心臟手術(shù)后急性腎損傷的早期跡象［13］。Haase等［14］對NGAL預(yù)測AKI的敏感性、特異性進行了薈萃分析，其準(zhǔn)確性為75%～95%。Brunner與Hinze分別對325例有免疫性或感染性腎病的患者、4 000多例有AKI可能的患者進行了NGAL檢測［15］，發(fā)現(xiàn)有損傷患者的NGAL要高于沒有腎損傷患者，根據(jù)NGAL的水平可提前1～3d預(yù)測AKI，提前12周預(yù)測慢性活動性腎病，可提前3個月診斷系統(tǒng)性狼瘡腎病，且NGAL的水平與腎損傷的程度具有相關(guān)性。2011年M.Haase等［16］又利用ROC曲線對NGAL預(yù)測AKI進行了探討，其中曲線下的面積為0.78，敏感性76%，特異性80%，不聯(lián)合肌酐檢測，NGAL獨立可以預(yù)測亞臨床的AKI。2012年Ampatzidou F［17］等研究發(fā)現(xiàn)NGAL是搭橋手術(shù)后預(yù)測急性腎損傷的“急性分子”。2013年最新研究發(fā)現(xiàn)NGAL同白介素－18（interleukin－18，IL－18）、微球蛋白（microalbumin，MA）、N－acetyl－β－D－glucosaminidase（NAG）、α1－微球蛋白（α1－microglobulin，α1－MG）及肌酐（creatinine，UCr）相比，是預(yù)測搭橋后急性腎損傷的最佳分子［18］。

3.2 NGAL與慢性腎損傷 NGAL在腎間質(zhì)纖維化早期發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用，對調(diào)節(jié)MMP－9／TIMP－1的平衡亦發(fā)揮重要作用［19］。M.Haase［20］等對慢性進展腎病患者（主要是免疫相關(guān)的：狼瘡腎病、LgA腎病、NACa動脈炎等）、感染性損傷（腹瀉溶血性尿毒綜合征）及其他原因造成的腎損傷患者（敗血癥、嚴(yán)重的臨床疾病、心臟手術(shù)、腎移植及腎毒性藥物）進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，在AKI的患者中NGAL的表達明顯上調(diào)，認為NGAL是很具有預(yù)測潛力的分子，并且NGAL上調(diào)的幅度與損傷的炎癥程度及持續(xù)時間相關(guān)。

3.3 NGAL免疫相關(guān)腎病 王素梅等［21］對99例T2DM（2型糖尿病）患者，根據(jù)尿白蛋白排泄率（Urinary albumin excretion rates，UAER）分組檢測NGAL等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在UARE＜20μg／min時，患者的血清中NGAL水平大幅升高，且隨著病情的加重NGAL水平亦逐漸增加。患者血清NGAL水平可反映腎損害的嚴(yán)重程度，是反應(yīng)早期腎損害的敏感指標(biāo)之一。Nielsen SE［22］發(fā)現(xiàn)在T1DM（1型糖尿病）患者中，尿NGAL水平隨尿白蛋白量增加而增加，且這種變化出現(xiàn)于T1DM腎病的早期，提示在T1DM中尿NGAL可作為早期DN（糖尿病腎病）腎小管損傷的診斷依據(jù)。

4 NGAL的檢測

在不同實驗研究中NGAL預(yù)測AKI的能力波動很大，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)不同形式NGAL具有不同的代謝機制，尿液中NGAL的單體和二聚體的來源可能由不同的機制參與，腎小管上皮細胞NGAL主要以單體形式釋放，因此檢測方法根據(jù)標(biāo)本來源及組織不同有不同檢測方法，檢測技術(shù)不斷提高。

4.1 免疫組織化學(xué)染色 基于免疫學(xué)的基本原理——抗原、抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，通過顯色劑標(biāo)記特異性抗體，化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定細胞、亞細胞水平的抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定量的研究，能準(zhǔn)確的定位NGAL在腎臟的表達。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 將已知濃度的NGAL標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品分別加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測。NGAL和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP酶標(biāo)志物。再一次溫育、洗滌，去除游離酶結(jié)合物，然后加入底物顯色，樣品中NGAL的濃度與顏色的深淺呈正比例關(guān)系。

4.3 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法（CMIA） 采用兩步法免疫檢測原理，用包被了單克隆抗體的微粒子與樣本中的NGNL結(jié)合，反應(yīng)洗滌后再加入吖啶酯標(biāo)記的NGNL抗體復(fù)合物來定量檢測患者樣本中的NGNL，該方法操作簡便，可于全自動分析儀上，僅需微量的血漿或者尿液，在短時間（30min）內(nèi)得到NGAL的定量結(jié)果，因此用于臨床NGAL的快速定量檢測，為臨床提供早期診斷具有較大價值。

5 展望

NGAL具有防御、免疫及調(diào)節(jié)等多種功能，作為早期腎損傷的標(biāo)記物，可以較血肌酐、白介素－18等經(jīng)典的腎臟損傷標(biāo)記物更早的發(fā)現(xiàn)腎臟損傷，為臨床及時治療早期腎臟損傷提供參考價值；動物試驗顯示可能其具有一定的治療功能，可能為腎臟疾病的治療提供新的途徑。由于檢測NGAL影響因素較多，各種方法之間的可比性的研究尚未深入，實驗室質(zhì)量控制尚未開展等問題的存在，廣泛應(yīng)用于臨床尚需要進一步的研究。

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