蘋果病毒病與無病毒苗木建園

姜中武 宋來慶 劉 娟 梁成林 趙建雪 趙玲玲

山東省煙臺市農業科學研究院·265500

蘋果病毒病是危害蘋果樹體生長的最主要的病害之一，給果農造成了嚴重的經濟損失。據報道，世界上幾乎所有栽培蘋果的國家和地區都有病毒的危害。截止目前為止，世界各地已報告的蘋果病毒已達有39種之多。根據病毒對蘋果的危害特點，通常把蘋果病毒分為潛隱性病毒和非潛隱性病毒兩大類：①潛隱性病毒。這類病毒一般在蘋果的栽培品種上不表現明顯的癥狀。我國分布最廣的是蘋果褪綠葉斑病毒 (ACLSV)、蘋果莖溝病毒(ASGV)和蘋果莖痘病毒(ASPV)。我國各蘋果產區主要栽培品種的潛隱性病毒的帶毒株率在60%～80%。②非潛隱性病毒。這類病毒侵染蘋果樹后，在大多數品種上都表現明顯的癥狀，根據其癥狀特點就可進行識別。我國主要有蘋果花葉病毒、蘋果綠皺果病毒和蘋果銹果類病毒。

1 蘋果病毒病的種類

1.1 蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）

為纖毛病毒科 （Flexiviridae）發狀病毒屬（Tricho virus）代表種。可侵染多種仁果類和核果類果樹，廣泛分布于世界各個果產區。該病毒侵染蘋果樹一般不產生明顯癥狀，但可與其他病毒復合侵染引起樹體衰退。梨樹感染該病毒后，在某些敏感的植株上產生褪綠斑或環紋花葉癥狀。該病毒還可引起核果類果樹果實環斑或葉片褪綠斑及裂皮等病害癥狀。該病毒侵染蘋果樹后，一般不表明癥狀，僅可影響產量。

1.2 蘋果莖溝病毒（ASGV）

是分布最為廣泛的蘋果病毒，可侵染多種禾本科植物，在果樹上主要通過嫁接和機械途徑傳播，關于該病毒的自然傳播途徑尚不清楚。該病毒侵染蘋果后一般不表現明顯的癥狀，但是可引起樹勢生長緩慢，產量降低，品質下降。2年生梨樹感染該病毒后，干徑生長速度降低63.0%，莖高降低58.0%，枝梢長降低51.0%；梨幼苗干莖降低11.7%，苗高降低13.5%。其生長緩慢主要原因與生長期幾種促進生長的內源激素（IAA、GA3、CTK）大幅下降有關。

1.3 蘋果莖痘病毒（ASPV）

可侵染多種果樹，分布非常廣泛。ASPV為潛隱性蘋果病毒，在大多數的蘋果品種上一般不表現癥狀，在一些敏感的砧木（virginia Crab）和栽培品種 （Charden和 Reinette Clochard）上癥狀較明顯，主要表現為葉片反卷、木質部莖痘斑、果實凹陷、葉偏上性生長。在梨樹上，ASPV能引起梨石痘病(Pear stony pit)、梨脈黃病(Pear vein yellow)等多種病癥。

1.4 蘋果花葉病毒（APMV)

除蘋果和梨外，APMV還有30多種寄主植物，主要為木本植物。APMV侵染蘋果后病樹葉片出現鮮黃色或黃白色斑，或深綠淺綠相間。按變色斑分布樣式，大體有斑駁型、網紋型、花葉型、環斑型、鑲邊型等幾種類型，各種類型的癥狀可能在同一枝或同一葉片混合出現。可使感病品種的樹體生長減少50%，樹干直徑減少20%，蘋果產量減少30%。主要通過嫁接和育苗圃根系嫁接傳播。

1.5 蘋果銹果類病毒（ASSVd）

可侵染多種核果類和仁果類果樹。其發病癥狀可由于品種和變種不同而不同。ASSVd在一些新品種上的癥狀主要是果面凹陷不平，而在一些老品種上主要花臉。目前在genebank中登記的蘋果ASSVd的變種序列達48條，煙臺市農業科學研究院研究表明，在蘋果上多為復合侵染，由多條ASSVd變種序列的復合物所侵染。

1.6 蘋果凹果類病毒（ADFVd）

該類病毒分布范圍比較廣，可侵染多種果樹。該病毒1996年首次在意大利發現，據報道該病毒侵染的蘋果品種主要有紅星、嘎拉、粉紅女士、布瑞本和富士等。其主要發病癥狀果實畸形帶有綠色的類似凹坑的斑點。

2 蘋果病毒病脫毒

2.1 熱處理

熱處理脫毒技術的原理是根據病毒和寄主植物對高溫忍耐程度的差異，在一定的溫度下(37～40℃)，病毒被鈍化，失去增殖和再感染能力，而寄主植物正常生長。經過一段時間((3～8周)的處理，枝條前端生長點附近不含有病毒顆粒，切除這部分進行人工培養或嫁接到無病毒的砧木上得到無毒的苗木。該技術的關鍵問題是寄主植物的存活率和脫毒率。處理溫度和高溫持續時間、處理方式、寄主植物所帶病毒種類等對存活率和脫毒率有影響。

2.2 莖尖培養

該技術脫毒的原理是依據在植物體內病毒濃度呈梯度變化，病毒顆粒隨植物組織的成熟而增加，旺盛生長的根尖、莖尖很少有病毒分布。莖尖的成活率和脫毒率是莖尖脫毒的兩個關鍵環節。作為脫毒所用的莖尖，一般以帶有1～2片葉原基，大小為0.1～0.2 mm為宜，超過0.5 mm時，脫毒效果差。莖尖大小、細胞分裂素濃度、繼代次數影響脫毒率。通過莖尖培養脫毒一般有以下幾個環節：①材料處理和接種；②誘導芽分化和小植株的增殖，誘導生根；病毒檢測；③生根植株的移栽；④移入苗圃。莖尖培養的最大缺點是莖尖不易培養，生根和移栽成活率低。在蘋果和草莓上應用二次莖尖脫毒可有效提高脫毒率。

2.3 熱處理結合莖尖培養

熱處理與莖尖培養結合是現有的效果最好的一種脫毒方法，尤其適用于單獨熱處理或莖尖培養難以脫除的病毒。該方法首先利用熱處理鈍化病毒，而后利用熱處理過的嫩梢進行莖尖培養，或將試管苗進行熱處理，之后再進行莖尖培養，可提高脫毒率30%～40%，所取莖尖大小因植物種類和待脫病毒種類而異，一般為0.5～2.0 mm。

2.4 莖尖微體嫁接

在莖尖培養的基礎上，Marashige等提出微體嫁接技術，即將莖尖分生組織嫁接在試管中經脫毒培養的砧木上得到完整的植株。微體嫁接解決了某些木本植物莖尖培養發根困難、生長緩慢的問題，并且可使復合侵染的病毒分離。該技術主要用于核果類果樹的脫毒處理。由于有些病毒通過種子或花粉傳播，嫁接前應對嫁接砧木進行病毒檢測。微嫁接成活率和脫毒率與莖尖大小、病毒種類和接穗來源影響有關。嫁接時莖尖大小一般為0.2～0.3 mm，即帶2～3個葉原基，既可除去病毒，又有較高的成活率。

2.5 化學處理

化學處理脫毒的作用機理是利用化學藥劑抑制植物病毒的復制來達到脫毒的目的。化學處理往往與組織培養結合進行，即先獲得待脫病毒樣品的莖尖培養植株，然后在進行離體植株培養的培養基中加入化學抑制物質，繼代培養一定時間后，再取新梢在無化學抑制劑的培養基上培養，經病毒檢測，保留無病毒的單株。抑制植物病毒活性的化學物質包括代謝拮抗物質、植物生長調節物質等，常用的抗病毒化學藥物有三氮唑核苷 (病毒唑)，5-二氫尿嘧啶和雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶。試驗證明，12.5 mg/L的抗病毒醚加入培養基80 d (40 d繼代1次)，可脫除ASGV和ACLSV，對其它病毒則無效。

2.6 超低溫處理

超低溫處理是新興的植物脫毒技術，是以超低溫保存和植物組織培養為基礎的一種方法。該技術的工作原理是利用液氮超低溫（-196℃）對植物細胞的選擇性殺傷，得到存活的頂端分生組織。這是由于頂端分生組織具有具有排列緊密、體積小、立方形、核質比高、細胞質濃稠、無成熟液泡的特點，細胞自由水含量低，在超低溫環境中細胞質能保持無定形狀態或產生不會造成細胞死亡的微小冰粒從而存活。而具有成熟液泡的已分化細胞，由于含有大量自由水在超低溫環境中會形成樹枝狀冰晶，這些冰晶破壞細胞的膜結構，從而導致細胞死亡。超低溫脫毒技術包括7個操作步驟，首先以帶毒的植物為材料進行組織培養建立試管苗體系，而后利用機械切割的方式獲得植物莖尖，對莖尖進行處理以增強其對干燥和超低溫的耐受能力，通常是將莖尖培養于含有高濃度蔗糖的培養基上使其脫水，干燥莖尖以增強其對超低溫的耐受力如無菌風干燥或玻璃化處理，液氮超低溫處理，莖尖復蘇及再生，再生植株的繼代繁殖及相關檢測。該方法采用1.0～1.5 mm的莖尖為試材，降低了試驗操作難度，具有操作簡便、實驗周期短、脫毒效率高等優點。缺點是種間差異大，不同品種需要分別建立脫毒技術體系，而且超低溫處理后莖尖存活率較低。

3 蘋果病毒病檢測

蘋果病毒病的檢測目前所采用的技術包括指示植物法、血清學檢測技術、分子生物學技術和電鏡技術。

3.1 指示植物法

該方法主要是通過不同的病毒在不同或相同的寄主植物上產生不同的癥狀來進行的。以對某種病毒十分敏感的植物作為指示物，將脫毒處理后獲得的植株，嫁接在指示植物上，根據病毒侵染指示植物后的癥狀，對病毒的存在與否及種類做出鑒別。常用的病毒指示植物主要有黎科、茄科、豆科、葫蘆科等植物。該方法缺點是特異性較差，靈敏度也較低，往往存在一病多癥、多病一癥的現象。檢測速度慢，受季節限制，獲得檢測結果所需時間長，該方法一般需要 1～2年。

3.2 血清學檢測法

目前最常用的血清學方法是酶聯免疫吸附法 (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay,ELISA)。ELISA是將抗原和抗體的免疫反應與酶的高效催化反應相結合而應用于植物病毒檢測的方法。其原理是通過化學的方法，將酶與抗體或抗原結合起來，形成酶標記物，具有活性的酶標記物與相應的抗原或抗體反應，形成更大的復合體，加入酶反應底物呈顏色反應，從而達到檢測病毒的目的。ELISA法檢測病毒具有成本低，適于測定大量樣品，靈敏度較高，可檢測ng(10-9g)水平的病毒，操作簡單，不需要使用同位素和復雜的設備，且對人體基本無害等一系列優點。但是，此法檢測需制備高質量的抗血清，免疫反應物消耗量較大，抗體(或抗原)被酶聯板吸附后與抗原(或抗體)的結合力下降，抗原與抗體結合比在液相中慢。而且有的病毒在某些情況下缺乏外殼蛋白，如類病毒則沒有外殼蛋白；受病毒系統和復合侵染的木本植物，鈍化病毒和制備抗血清難于完成；寄主植物中低濃度的病毒無法檢測。檢測時有假陽性反應，需要設置各種對照。

3.3 分子生物學檢測

分子生物學方法是通過檢測病毒核酸來證實病毒的存在，該技術比ELISA靈敏度高、特異性強、快速，可用于大量樣品的檢測，并且適應范圍廣，其應用的對象為RNA病毒、DNA病毒及類病毒。目前常用的分子生物學技術包括核酸分子雜交技術、雙鏈RNA電泳技術、RTPCR技術。

3.3.1 分子雜交技術 利用互補的核苷酸序列通過堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子的過程來進行的，檢測對象是基因組DNA或總RNA。該方法特異性強，靈敏度高，可檢測到lpg的植物病毒基因組DNA，但存在同位素標記有放射性污染，cDNA探針半衰期短的缺點。

3.3.2 雙鏈RNA電泳技術 其原理是ssRNA病毒在植物體內增殖，通過核酸互補而形成一種健康植物沒有的堿基配對dsRNA。dsRNA經提純、電泳、染色后，在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性，并且有些單個病毒的dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特征。因此，利用病毒dsRNA的電泳圖譜可以檢測出病毒的類型和種類。已知和未知的病毒及低濃度的病毒，具有快速、靈敏、簡便等優點。但鈍化dsRNA比較麻煩，不能檢測小于ng級水平及大規模樣品。

3.3.3 RT-PCR技術 是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法，是目前應用最為廣泛的果樹病毒檢測技術。該技術克服了上述兩種技術的缺點，可檢測fg（10-15g）濃度的植物病毒及大規模的樣品。近年來發展了復合RT-PCR是在同一RT-PCR反應體系中用幾對不同的引物同時檢測多個目的片段。 應用復合RTPCR和用單一RT-PCR做相同數目的病毒檢測相比，節約了時間和試劑。PCR技術用于植物病毒的檢測具有特異性強、靈敏度高、快速簡便又無放射性的危害。近來，又衍生出一些以PCR技術為基礎的病毒檢測方法，如RT-PCR法、IC-PCR法、IC-RT-PCR法、PCR微量板雜交法，套式PCR等。在RT-PCR基礎上又發展了IC-RT-PCR和多重IC-RT-PCR。與RTPCR相比，IC-RT-PCR技術可使靈敏度提高1250倍，多重IC-RT-PCR可以準確的同時檢測出兩種以上癥狀相似、難以區分的病毒。

3.4 電鏡技術

電子顯微鏡以電磁波為光源，利用短波電子流，分辨率可達到0.1 nm，而病毒粒體大小為10～100 nm，采用電鏡觀察有無病毒存在。利用該方法應該首先對不同病毒組的形態和典型病毒的特點有所了解，將病毒粒體經過提純，用超速離心機反復低溫離心，將病毒粒子提純分離出來。而后用提純液進行電鏡制片，觀察病毒形態結構。由于電子穿透能力低，樣品必須很薄，制樣需選取病毒濃度最高的組織。

4 已獲的脫毒蘋果品種

由于蘋果病毒病是一種系統性疾病，到目前為止，尚沒有有效的防治方法，培育無病毒苗木是唯一有效的途徑。我國蘋果無病毒蘋果的培育始于上世紀90年代，經過20多年的研究，利用不同的脫毒方法，目前已獲得30多個蘋果脫毒品種和砧木。這些品種主要包括煙臺市農科院果樹所培育的煙富3號、青島農業科學研究所董淑英獲得的長富1、早生喬納金，甘肅農業大學吳玉霞獲得的華紅、紅將軍等12個品種，粉紅佳人、煙富1號，以及河北農業大學晏娜利用化學處理和熱處理獲得了王林、喬納金、嘎拉、金冠、珠美海棠、天紅1號、M9等22個品種（砧木）。

5 脫毒苗木建園

5.1 脫毒苗木園地選擇

脫毒苗木植株長勢健壯，和常規苗木相比，其株行距應略大，平原地、土壤肥沃的土地，行距最少為5.0 m，可選用3.0 m×5.0～6.0 m的寬行密植建園模式。建園時應配置適當的授粉樹。

5.2 栽植時采用行間起壟栽培模式，行間種植黑麥草和鼠茅草或自然生草

秋施基肥一般每667 m2施3000～5000 kg有機肥，混施100 kg氮、磷、鉀復合肥；生長季土壤含水量應穩定在田間最大持水量的60%～80%；有條件的果園可安裝噴滴灌或水肥一體化設施，提高肥水利用效率。幼樹期，前期以氮肥為主，后期以磷、鉀肥為主，尤其是在8月份后應嚴格控制氮肥的投入。相同管理條件下，脫毒苗長勢強勁，苗木增長快，后期果園氮肥充裕易出現停長期而不能及時停長的現象，冬季易發生凍害。

5.3 脫毒蘋果品種長勢健壯，對枝干輪紋病等病害的抗性較強，生產上應按照常規蘋果苗木管理方式做好病蟲害的防治

秋季果樹落葉后，進行樹干涂白，防止冬季凍害和幼樹抽條。