CX3CL1、CX3CR1在胃癌及癌旁組織中的表達研究

陳 維 周 濤 呂成余

南京醫科大學附屬南京醫院（南京市第一醫院）普外科，江蘇省南京市 210006

CX3CL1（Fractalkine）于1997年發現，是目前CX3C類 趨 化 因 子 中 唯 一 成 員［1］。CX3CR1是CX3CL1的特異性受體，屬于趨化因子受體超家族。CX3CL1／CX3CR1可誘導白細胞黏附及游走移行，并介導免疫損傷。近年發現，CX3CL1／CX3CR1在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。但在人胃癌中，有關CX3CL1／CX3CR1的研究較少。本研究應用ELISA和Western Blot法檢測胃癌組織及對應癌旁組織中CX3CL1、CX3CR1的表達情況，探討其在胃癌發病過程中的作用。

1 資料及方法

1.1 一般資料 選取2012年7月－2013年3月本院普外科手術切除的胃癌組織30例，男19例，女11例；年齡38～81歲，中位年齡63歲；術前均未接受化療或放療。術中取成對的癌組織和癌旁組織（距癌變部位邊界5cm以外且經病理證實無癌變的組織）。

1.2 主要試劑 人CX3CL1ELISA試劑盒購自USCN公司，全蛋白定量試劑盒購自南京凱基。兔抗人CX3CR1抗體為abcam公司產品，內參（rabbit β－Actin）購自Immunoway公司，羊抗兔IgG購自Jackson公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ELISA方法：將所取組織剪成小塊，加入細胞裂解液，于勻漿器中勻漿，離心后取上清。依照全蛋白定量試劑盒操作說明，配置蛋白標準液，繪制蛋白定量標準曲線。取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭G250染液990ml，混勻，測定595nm OD值，然后在標準曲線上求得總蛋白濃度。按人CX3CL1ELISA試劑盒操作步驟，檢測待測蛋白樣品，結合總蛋白濃度，計算出各組織標本中CX3CL1含量。

1.3.2 Western blot檢測：取胃癌組織和癌旁組織各100mg，加入400μl裂解液勻漿后，充分裂解。將上清分裝，存于－70℃備檢。取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭G250染液990ml，混勻，測定595nm OD值，然后在標準曲線上求所得濃度。以β－actin的水平作為等量蛋白質上樣對照，將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為70μg，并于95～100℃5min后冰上冷卻上樣。電泳條件：濃縮膠恒壓80V約30min，分離膠100V約90min。將分離的蛋白質電轉移至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉封閉液中4℃封閉過夜。加入封閉液和適量一抗抗體CX3CR1（1∶400）。搖床搖蕩4℃孵育過夜。TBST漂洗PVDF膜4次×10min。將膜與HRP結合的二抗（辣根過氧化酶標記抗體，二抗用封閉液稀釋1∶5 000）室溫下搖蕩孵育2h，然后用TBST充分洗膜4次×10min。將顯影液加于PVDF膜上，曝光，顯影，洗像后觀察結果，進行灰度分析。以CX3CR1條帶灰度值與β－actin條帶灰度值比值表示各組織中CX3CR1的表達水平（灰度值為條帶密度值及面積值的乘積，設空白對照相對密度值為0）。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0軟件，用兩樣本配對t檢驗比較胃癌組織和對應癌旁組織的CX3CL1及CX3CR1的表達水平。

2 結果

2.1 胃癌組織和對應癌旁組織中CX3CL1的表達

ELISA結果顯示CX3CL1在胃癌組織中的水平高于對應癌旁組織（表1）。

表1 CX3CL1、CX3CR1在人胃癌組織及癌旁組織中的表達比較

2.2 胃癌組織和對應癌旁組織中CX3CR1的表達

Western blot檢測顯示，30例胃癌組織及對應癌旁組織中均存在CX3CR1的表達。經圖像分析系統分析表明，CX3CR1在胃癌組織中的表達水平高于對應癌旁組織（P＜0.05）（表1）。部分組織標本Western blot檢測結果見圖1。

圖1 部分胃癌和癌旁組織中CX3CR1及內參照的表達

3 討論

趨化因子（chemokines）是分子量為8 000～12 000的小分子細胞因子，對中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞等多種細胞均有趨化作用，趨化因子通過與相應的G蛋白偶聯受體超家族結合發揮作用。CX3CL1是CX3C類趨化因子中的唯一成員，它由激活的內皮細胞及神經細胞所表達，與其他趨化因子不同的是，CX3CL1的趨化因子區域表達在細胞膜外粘蛋白樣莖狀結構頂部，它本身又是一種黏附分子，因此除了具有趨化功能外，還具有黏附作用，介導細胞間黏附［2］。而其同源受體CX3CR1主要在細胞毒性效應淋巴細胞（包括NK細胞、細胞毒T淋巴細胞和巨噬細胞）上表達，此外腫瘤細胞也表達CX3CR1［3］。

目前CX3CL1／CX3CR1在腫瘤中的具體機制還存在爭議。一些研究表明，作為化學誘導物，CX3CL1／CX3CR1可激發白細胞的抗腫瘤作用，CX3CL1與CX3CR1結合后可誘導NK細胞、CD8＋T、CD4＋T向腫瘤細胞聚集并使其黏附于腫瘤細胞，從而發揮抗腫瘤作用［4～6］。而另一些研究認為，CX3CL1可作為黏附分子與腫瘤細胞表達的CX3CR1結合，在腫瘤發生發展及轉移中發揮作用［7，8］。在一些 腫瘤中，CX3CL1上 述 這 種 潛 在 的 抗癌作用因為其促腫瘤發展作用而被抵消。這可能就是腫瘤在CX3CL1／CX3CR1系統的作用上形成臨床差異報道的關鍵因素［9］。在筆者的研究中，通過ELISA法顯示CX3CL1在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，western blot檢測結果證實了CX3CR1在胃癌組織中的表達也明顯高于癌旁組織，提示CX3CL1、CX3CR1的過量表達可能參與了胃癌的發生發展過程。筆者認為存在兩種可能的過程：（1）胃癌組織中CX3CL1高表達，趨化表達CX3CR1的淋巴細胞、巨噬細胞和NK細胞等免疫活性細胞聚集于胃癌組織，從而使胃癌組織中CX3CR1也呈高表達；（2）胃癌細胞自身高表達CX3CR1，趨化游離的CX3CL1向胃癌組織聚集，使胃癌組織中CX3CL1呈高表達。這兩種可能性都具有積極的臨床意義：如果是前者，可多一個新的方向研究胃癌的腫瘤基因治療及免疫治療；而如果是后者，則可進一步從基因水平探討CX3CR1的表達在胃癌細胞生成過程中的角色及腫瘤標志物的可能。

當前有關CX3CL1／CX3CR1系統與胃癌關系的文獻僅有個別報道，Hyakudomi［10］等對158例T2或T3期的胃癌進行了CX3CL1的檢測，同時評估NK細胞、CD8＋T細胞的浸潤程度后發現，在無瘤生存期上，CX3CL1高表達組相比較于低表達組有著更好的預后，通過多因素分析結果顯示CX3CL1表達是影響胃癌患者無瘤生存期的獨立因素。目前為止對趨化因子參與的腫瘤免疫學的研究及治療尚不能形成完全的理論，還需更廣泛的研究來揭示其秘密。筆者希望通過對CX3CL1／CX3CR1系統及其與胃癌關系的進一步研究，為胃癌的診斷和治療中提供新的思路與方法。

［1］ Bazan JF，Bacon KB，Hardiman G，et al.A new class of membrane－bound chemokine with a CX3Cmotif〔J〕.Nature，1997，385（6617）：640－644.

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［3］ Marchesi F，Piemonti L，Fedele G，et al.The chemokine receptor CX3CR1is involved in the neural tropism and malignant behavior of pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Cancer Res，2008，68（21）：9060－9069.

［4］ Pan Y，Lloyd C，Zhou H，et al.Neurotactin，a membrane－anchored chemokine upregulated in brain inflammation〔J〕.Nature，1997，387（6633）：611－616.

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［6］ Matsubara T，Ono T，Yamanoi A，et al.Fractalkine－CX3CR1 axis regulates tumor cell cycle and deteriorates prognosis after radical resection for hepatocellular carcinoma〔J〕.J Surg Onc，2007，95（3）：241－249.

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［8］ Shulby SA，Dolloff NG，Stearns ME，et al.CX3CR1－fractalkine expression regulates cellular mechanisms involved in adhesion，migration，and survival of human prostate cancer cells〔J〕.Cancer Res，2004，64（14）：4693－4698.

［9］ D’Haese JG，Demir IE，Friess H，et al.Fractalkine／CX3CR1：why a single chemokine－receptor duo bears a major and unique therapeutic potential〔J〕.Expert opinion on therapeutic targets，2010，14（2）：207－219.

［10］ Hyakudomi M，Matsubara T，et al.Increased expression of fractalkine is correlated with a better prognosis and an increased number of both CD8＋T cells and natural killer cells in gastric adenocarcinoma〔J〕.Ann Surg Onc，2008，15（6）：1775.