結核生物蛋白芯片在結核病早期診斷中的應用

劉 偉

（吉林省白城市傳染病醫院，吉林 白城 137000）

結核生物蛋白芯片在結核病早期診斷中的應用

劉 偉

（吉林省白城市傳染病醫院，吉林 白城 137000）

目的通過分析結核分枝桿菌LAM、16KD、38KD抗原的IgG抗體說明其檢出率和早期診斷意義。方法對2013年1月至2013年5月來白城市傳染病醫院門診和住院的就診229例患者分別應用蛋白芯片法進行定性檢測，隨機抽取其中96例陽性者進行痰涂片抗酸染色法定性檢測。結果在229例血清檢測標本中，結核抗體陰性標本者114例，結核抗體陽性者115例，檢出的陽性率為50.22%。隨機選擇96例蛋白芯片法檢測陽性者做痰涂片抗酸染色法定性檢測，痰涂片陽性者僅為17例，陽性率僅為17.71%。結論作者認為采用生物蛋白芯片技術聯合檢測3種結核抗體，可提高其診斷結核病的敏感性和特異性，并作為結核病的血清學早期診斷方法之一。

結核分枝桿菌；LAM抗原；16KD抗原；38KD抗原；IgG抗體；蛋白芯片技術；早期診斷；痰涂片；比較性分析

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種常見慢性傳染病，可見于全身的各個組織器官，但以肺結核最多見。據統計，全球現有活動性肺結核患者2000多萬，我國有4億人感染過結核菌，是世界上22個結核病高負擔國家之一，患者人數居全球第二位。X線檢查、痰液微生物學檢查和蛋白芯片法是白城市傳染病醫院臨床診斷結核病的主要方法，其中蛋白芯片法是近年來蛋白質組學研究中興起的一種新方向，其基本原理是以微孔濾膜為載體，利用微陣陳列技術將純化的結核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）蛋白，16KDa（rTPA16）和38KDa（rTPA38）等3種抗原固相于同一膜片上，在固相膜上使抗原抗體反應快速進行，在以免疫全作為標志物在膜上顯色，然后放入芯片閱讀儀，在專門軟件的支持下對抗原點陣以灰度值進行分析，以達到檢測結核桿菌的目的。本文以結核生物蛋白芯片法檢測2013年1月～5月期間來白城市傳染病醫院門診和住院的就診229例患者的血液標本，在統計陽性率的基礎上，與痰液微生物定性檢查結果相比較。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

以2013年1月至2013年5月來白城市傳染病醫院門診和住院的就診229例患者為研究對象，其中男性131例，女性98例。常規采集靜脈血液標本待應用蛋白芯片法檢測，并隨即選擇96例陽性者進行痰涂片抗酸染色法檢測。

1.2 儀器及試劑

南京大淵生物技術工程有限責任公司生產的PBT-X4型生物芯片識別儀，結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒（蛋白芯片）。

1.3 操作方法

取靜脈血2 mL，分離血清，在芯片上標記上樣品編號，在芯片盒窗口內滴加200 μL試劑A，使膜表面完全浸濕；待血清完全滲入后，室溫放置1 min。將待檢血清100 μL加入窗口中，待血清完全滲入后，再滴加300 μL試劑B，待試劑B完全滲入后，滴加500 μL試劑C，待試劑C完全滲入后，最后滴加300 μL試劑D，反應完畢后30 min內將芯片放入芯片識別儀進行結果分析，在確保沒有開啟任何應用程序的情況下，把芯片盒內的小光盒放入光驅，機器會自動進入生物芯片檢測軟件，然后按程序操作，并打印出分析結果。痰液微生物檢查主要采用涂片抗酸染色法，操作方法參見《結核病診斷細菌學檢驗規程》[1]。

1.4 結果判定

LAM、16KDa、38KDa的IgG抗體有任一指標為陽性，均確定為結核分枝桿菌感染。如IgG抗體均為陰性，提示未感染結核分枝桿菌。

2 結 果

2.1 蛋白芯片法檢測結果

在229例血清檢測標本中，結核抗體陰性標本者114例，結核抗體陽性者115例，檢出的陽性率為50.22%。其中，16Kda、38Kda和LAM均陽性者10例，單純16Kda陽性者4例，單純38Kda陽性者5例，單純LAM陽性者19例，16Kda和LAM陽性者6例，38Kda和LAM陽性者71例。

2.2 蛋白芯片法與痰涂片抗酸染色法定性檢測結果比較

在115例蛋白芯片法陽性標本中，隨機選擇96例進行痰涂片抗酸染色法定性檢測，其中痰涂片陽性者為17例，陽性率僅為17.71%。

3 討 論

結核病是世界衛生組織和我國重點防治的重大傳染病之一[2]。早期結核病患者均有非特異性的一般癥狀，目前在肝臟、胰腺、腎臟、腹膜和骨骼等組織器官感染結核分枝桿菌的機會較高，肺外結核的發病率越來越高，有時傳統的診斷方法的假陰性率較高，致使大量結核病患者未能及時被及時診斷而延誤治療時機，這是目前結核病病死率急劇升高的重要原因之一。因此，如何早期診斷結核病，成為提高人群尤其是高危人群和患患者群健康水平一個重要手段，是結核病第二級預防的重要手段和措施。由于痰吐法、培養法和皮試法等診斷手段有的所需時間長，有的檢出陽性率低，因此，世界衛生組織要求各個國家和地區進一步開發新的體外診斷試劑，生物蛋白芯片技術為一種重要的手段之一。

生物蛋白芯片技術檢測結核分枝桿菌抗體較敏感和特異的純化抗原為細胞壁LAM、16KDa蛋白和38KD蛋白，LAM是構成結核分枝桿菌細胞壁的重要組成成分，其特異性強，能刺激結核感染者產生抗體。16KDa蛋白是有潛力的免疫診斷抗原，38KDa蛋白為脂蛋白，其與細胞膜或菌體表面的脂肪結構相連。結核病的免疫特征是細胞免疫功能低下，體液免疫功能增強。當治療有效，感染控制后，LAM、16KDa、38KDa抗體水平下降。

生物蛋白芯片技術檢測結核分枝桿菌的基本原理為：本文結果表明，229例門診及住院結核病患者的結核分枝桿菌抗體檢出率均高，尤其是LAM陽性者較高（為106例），占陽性總數的92.17%，提示血清LAM抗體是診斷結核病的重要標志之一[3]，其診斷的特異性較高[4]；本文結果說明生物蛋白芯片技術能動態監測這3種結核抗體，可用于結核病的藥物治療選擇的客觀依據；本文還顯示LAM、38KDa抗體檢出率隨結核病患者的年齡增加而升高，可能與年齡增加機體抵抗力或免疫力下降。在115例標本中蛋白芯片法陽性標本中，隨機選擇96例痰涂片抗酸染色法定性檢測，其中痰涂片陽性者為17例，陽性率僅為17.71%。說明，生物蛋白芯片技術有助于結核病的早期診斷。

綜上觀點，作者認為采用生物蛋白芯片技術聯合檢測3種結核抗體，可提高其診斷結核病的敏感性和特異性，并作為結核病的血清學診斷方法之一。生物蛋白芯片技術應用于結核分枝桿菌抗體的檢測，不僅可以快速準確地檢測血清中的相關各種抗體，而且還可以在不同人群中篩查出不同的抗體類型，為臨床結核病尤其是肺外結核的診斷及預后估測等提供重要的依據。

生物蛋白芯片技術檢測結核分枝桿菌抗體適用于：①用于活動性結核病菌感染引起的疾病特異性抗體檢測，可作為結核病的血清學診斷方法之一。②非活動性感染及接受過卡介苗接種者。③痰涂片、培養檢測為陰性的人群檢測。④肺部其他疾病的鑒別診斷和結核病化療后的動態觀察。

應用該方法時，對標本有嚴格要求：①靜脈血清體積應在150 μL以上；②溶血標本和高脂血樣本不適宜本方法；③新鮮血樣在2～8 ℃環境下存放不要超過48 h；④長期保存的樣本應在-20 ℃以下保存，避免冷凍和反復凍融。

在檢測過程中應注意：①2～8 ℃環境下取出的芯片和試劑需在室溫下平衡10 min方可使用。②每盒芯片配套1張校正光盤，只對該盒內的芯片有效，不能與其他芯片混用；芯片反應窗口膜不能損傷或受潮。③芯片陽性控制點不顯色，說明已經失效，應取一新芯片重做。④殘余標本和用過的芯片，按照生物危險品進行常規消毒處理。⑤操作時必須戴手套，檢測完畢徹底洗手。⑥眼部如接觸任何試劑，立即大量清水沖洗，如仍有不適，應立即就醫。

該方法的優點表現在：①檢測速度快，適合快速診斷要求。試劑穩定，不同的檢測單位和不同批號的試劑檢測可獲得穩定一致的結果。②可以單人份操作，既可以方便患者又可以節約試劑。③結果的判斷采用芯片識別儀避免了人為主觀誤差。其缺點表現在：①價格相對昂貴，不適用于大規模血清流行病學調查。②標本必須新鮮，對于黃疸血清和溶血標本亦可出現假陰性結果。③重癥結核患者，當其免疫力極度低下時可能無法檢出抗體。

對結核病做出快速而準確的診斷，一直是臨床工作中的重點和難點，探索更有特異性、敏感性、實用性的實驗診斷的指標和方法具有重要的意義。本文的觀察結果表明，生物蛋白芯片技術是可被選擇的手段之一，對結核病的早期診斷有一定意義。

[1] 中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程[J].中國防癆雜志, 1996,18:18-31.

[2] 張秀珍,胡云建,陳東科.結核病實驗診斷進展[J].中華檢驗醫學雜志,2005,28(8):865-866.

[3] 汪偉明,周國平,張鋼.血清LAM-IgG抗體對結核病的診斷價值[J].中國血液流變學雜志,2001,11(3):219-220.

[4] 孔忠順,管波清,古淑香,等.血清抗脂阿拉伯甘露糖及38kDa抗體檢測對涂陰肺結核及肺外結核診斷價值[J].中國防癆雜志, 2002,24(3):140-142.

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B

1671-8194（2014）13-0197-02