馬拉色菌臨床鑒定研究進展

尹斌 冉玉平

馬拉色菌臨床鑒定研究進展

尹斌 冉玉平

嗜脂性酵母馬拉色菌屬(Malassezia spp.)是人類和動物皮膚上的常駐菌群,由于生長依賴于脂質(厚皮馬拉色菌除外),主要分布于皮脂豐富部位,如頭皮、面部、胸背部,約占健康人皮膚定植真菌總量的50%～80%[1-2]。作為條件致病菌,馬拉色菌與多種人及動物皮膚疾病相關,包括直接感染皮膚組織所致的花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎;通過免疫機制參與某些疾病的發生發展,如,脂溢性皮炎、特應性皮炎、痤瘡、甲真菌病、銀屑病、包皮龜頭炎、外耳道炎、融合性網狀乳頭瘤病等。抗真菌藥物是治療馬拉色菌感染的主要手段,但不同種類馬拉色菌對他克莫司、唑類等藥物的敏感性不同[3-4],因而其分類鑒定的臨床重要性日益顯現。

一、馬拉色菌的分類

1853年Robin從花斑糠疹患者皮損處培養分離出馬拉色菌,但直到1889年Baillon才首次提出了馬拉色菌(genusMalassezia)的概念。在其后的約一百年間,馬拉色菌屬的命名和分類非常混亂。1990年代,通過對各菌種形態學和生理生化學特性的研究,以及脈沖凝膠電泳(PFGE)、隨機擴增多態性分析(RAPD)和核糖體RNA(rRNA)基因序列分析的應用,定義和命名了7種馬拉色菌:糠秕馬拉色菌(M.furfur)、合軸馬拉色菌(M.sympodialis)、鈍形馬拉色菌(M.obtusa)、球形馬拉色菌(M.globosa)、限制馬拉色菌(M.restricta)、斯洛菲馬拉色菌(M.slooffiae)和厚皮馬拉色菌(M.pachydermatis)。自2002年起通過rRNA基因序列分析和限制性片段長度多態性(RFLP)等方法陸續發現了7種馬拉色菌新種:皮膚馬拉色菌(M.dermatis)、日本馬拉色菌(M.japonica)、大和馬拉色菌(M.yamatoensis)、納娜馬拉色菌(M.nana)、羊馬拉色菌(M.caprae)、馬馬拉色菌(M.equina)和兔馬拉色菌(M.cuniculi)[5]。目前,已發現上述14種馬拉色菌中有11種參與人體皮膚微生態構成[6]。隨著馬拉色菌研究的不斷進展,菌種分類體系的建立已深入至相關疾病與特定菌種之間關系的研究,其中重要一環是準確鑒定在皮膚表面分布的馬拉色菌群(Malasseziamicrobiota)。

二、依賴于培養的馬拉色菌鑒定方法

1.傳統的形態生理生化鑒定:臨床對酵母菌的鑒定主要是基于其生化特征,API20C AuxTM和ID 32C APITM(bioMérieux)是最常用的酵母菌鑒定商用試劑盒,能在48 h內分別鑒定47和69種酵母菌,但由于它們無法提供馬拉色菌生長需要的脂質營養而不能用于馬拉色菌的鑒別[7]。根據馬拉色菌對脂源的同化、七葉苷分解、過氧化氫酶實驗及形態學的不同,形成了一套形態學及生理生化鑒定系統[7],包括:①沙堡弱培養基(Sabouraud dextrose agar,SDA)生長試驗;②改良Dixon培養基溫度生長試驗;③吐溫20、40、60、80利用試驗;④七葉苷分解試驗(Esculin solution test);⑤過氧化氫酶試驗(Catalase test);⑥PGE-35蓖麻油試驗(Castor oil test)。該系統聯合應用CHROMagarTM馬拉色菌培養基可進一步提高鑒定準確性。Kaneko等[8]分析9種370株馬拉色菌,有363株(98.1%)得以準確鑒定。Ramadán等[9]對200株花斑糠疹皮損區臨床分離株進行鑒定,結果顯示51%為合軸馬拉色菌,40%為球形馬拉色菌,隨后為糠秕馬拉色菌(7%)、鈍形馬拉色菌(1%)與斯洛菲馬拉色菌(1%)。

隨著分子生物技術的迅速發展,傳統方法所固有的不足逐漸顯現:馬拉色菌菌種之間除球形馬拉色菌外沒有太多形態學特征可供鑒別;培養過程常被其他酵母菌污染,鑒定前必須反復多次劃線純化以獲得單菌落;部分菌種生長緩慢(如球形、限制馬拉色菌),易被生長較快的菌種(如糠秕馬拉色菌)競爭性抑制;形態學和生化鑒定操作復雜,周期長,受培養方法及實驗者主觀判斷影響較大,導致菌種分布情況在不同的研究報告中存在較大差異,尤其是在生化鑒定與分子生物學鑒定方法之間。

2.rRNA基因序列分析:真菌rRNA內轉錄間區(internal transcribed spacer，ITS)、5.8S rRNA 基因、D1/D2 26S rRNA 基因和基因間間隔1區(intergenic spacer region 1，IGS 1)隨菌種不同而有所差異,而在種內其長度通常恒定,其中ITS區和D1/D2 26S rRNA基因被廣泛用于真菌鑒定。對于馬拉色菌屬而言,同種間D1/D2 26S rRNA基因DNA相似性大于99%;而各馬拉色菌菌種間ITS區的長度從161～266 bp不等,而且球形與限制馬拉色菌還表現出種內的序列多樣性[7]。很多種馬拉色菌只需要進行D1/D2 26S rRNA基因測序即可鑒別,但合軸馬拉色菌以及進化關系與其緊密相關的馬、羊、皮膚馬拉色菌除外。這4種馬拉色菌的D1/D2 26S rRNA基因序列相似性超過98%～99%,其ITS1區和ITS2區的基因序列相似性分別為82%～93%和88%～95%。因此當菌株考慮為合軸以及與其緊密相關的馬拉色菌時,推薦D1/D2 26S rRNA基因測序和ITS區基因測序聯合進行。IGS區測序可用于馬拉色菌,但適用于流行病學調查。根據IGS1區序列的變異,發現某些球形馬拉色菌菌株對特應性皮炎可表現出一定程度的偏向性[10-11]。對限制馬拉色菌的研究[12]也發現,來源于正常皮膚與來源于特應性皮炎的菌株,IGS1區序列具有明顯的差異。

3.其他基于分子技術的鑒別方法:隨機擴增多態性DNA可用于特定馬拉色菌菌種的標記和基因圖譜研究,有研究采用該方法對分離自花斑糠疹、脂溢性皮炎合并HIV的糠秕馬拉色菌進行分型和相互比較[13]。應用擴增片段長度多態性(AFLP)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析已成功鑒定出馬拉色菌菌種和糠秕馬拉色菌種內差異性[14]。采用限制性片段長度多態性分析(RFLP)對糠秕馬拉色菌ITS2區進行分析,表明菌株具有明顯的地理差異性,如從歐洲東南部分離的糠秕馬拉色菌株,較自歐洲其他地方分離的菌株缺乏BanⅠ酶切位點,其差異具有統計學意義[15]。對厚皮馬拉色菌的ITS1區及核糖體大亞基rRNA進行測序和單鏈構象多態性(SSCP)分析可將厚皮馬拉色菌分為3個主要的基因簇,其中兩個與皮損區皮膚和高磷脂酶活性有關[16],由此可分析馬拉色菌生理特性和不同菌株的來源。

三、不依賴于培養的鑒別方法

準確地鑒定皮膚表面馬拉色菌群要求待測標本中所有種類的馬拉色菌均能在培養基中生長復蘇,然而沒有任何一種培養基能滿足所有馬拉色菌的生長要求。盡管依賴于培養的方法可以產出相當數量的活細胞,但各種馬拉色菌對營養條件的依賴性、生長活性的不同以及分離污染的干擾,依靠培養法所得出的鑒定結果不可避免地存在一定的誤差,無法取得準確的分析結果。因此基于分子生物學技術、不依賴培養的馬拉色菌鑒定方法得以開發應用。

1.臨床樣本直接提取馬拉色菌DNA:Tajima等[11]開發出一種從臨床標本中直接提取馬拉色菌DNA并進行菌種鑒定方法:可選用棉棒擦拭、手術刀刮取、醫用透明敷貼粘貼或適當緩沖液沖洗皮屑(推薦敷貼粘貼,簡單、易操作且對皮膚無損傷)。敷貼粘貼取樣部位3次以獲得足夠量的真菌DNA[11],將敷貼置于DNA提取液加熱,然后加入Ethachimate催化沉淀進行提取。Zhang等[17]則選取適宜濃度的Triton X-100,先對采集標本的敷貼進行充分洗滌后再行后續的提取和擴增,以保證采集的菌量。DNA測序并分析馬拉色菌rRNA基因ITS區和D1/D2 26S rRNA基因是最可靠和準確的鑒定提取是否成功的方法:采用引物ITS1和NL4進行PCR擴增,產物用引物ITS1和ITS4,或者NL1和NL4測序,所得序列上傳到 GenBank進行 blast比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)。若D1/D2 26S rRNA基因的相似性＞99%,則可鑒定為同一菌種[7]。

2.巢式PCR:由兩套PCR引物(巢式引物)進行兩輪PCR反應。首先在常規條件下用第1套跨越目的DNA片段的外引物擴增,第2套內引物結合在第1次PCR產物內部,使得第2次PCR擴增片段短于第1次擴增。由于有2次PCR擴增,巢式PCR法增加了檢測的敏感性;同時又有2套PCR引物與檢測模板配對,增加了檢測的可靠性。Morishita等[18]采用巢式PCR法對花斑糠疹患者所攜帶的9種親人性馬拉色菌進行了定性分析,從93.9%患者皮損區分別檢測出球形馬拉色菌及限制馬拉色菌,而其他菌種低于35%。Kaga等[19]對56例成人特應性皮炎患者進行鑒定,并與32例健康個體比較,約60%的患者檢測出合軸馬拉色菌,其余菌種檢出率為10%～40%,健康個體與特應性皮炎患者間無明顯差異;Zhang等[17]設計了10對巢式引物進行特異擴增,檢測中國146例脂溢性皮炎患者,分別從87.0%和81.5%患者皮損區分離出球形馬拉色菌及限制性馬拉色菌,同時隨機抽取60份標本采用傳統培養生化方法進行分離鑒定,結果顯示,非培養直接DNA提取法在研究菌種構成方面較傳統培養生化方法準確且簡捷。

3.實時熒光定量PCR:采用特異性TaqMan探針和非特異性SYBR GreenⅠ熒光染料的兩種實時熒光定量PCR均已用于定量分析非培養樣本的馬拉色菌DNA。SYBR GreenⅠ熒光為一種雙鏈DNA結合熒光,可擴增所有雙鏈DNA,檢測靈敏度高;不需要設計探針,降低了成本。但其對PCR反應過程中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光,從而降低了特異性,必須使用熔解曲線或凝膠分析來檢查非特異性產物的構成。TaqMan探針具有基因特異性序列,可與兩個PCR引物之間的靶點結合,檢測在PCR循環期間聚積的某種特異性PCR產物。與SYBR GreenⅠ熒光染料相比,TaqMan探針對目標序列的特異性更高,其引物設計相對簡單,實驗重復性好,但探針設計要求較高,成本也更貴。Akaza等[20]以棉棒擦拭40例日本健康個體皮膚取樣,設計9對馬拉色菌種特異性引物,采用SYBR Green熒光染料+ROX進行實時熒光PCR檢測,分析季節、性別、部位與馬拉色菌菌種分布的關系。Sugita等[21]采用TaqMan探針實時熒光PCR對特應性皮炎皮損處馬拉色菌菌群進行定量定性研究。該方法設計3對特異性引物以及與之對應的TaqMan熒光探針,分別擴增馬拉色菌屬及2種主要的馬拉色菌(球形馬拉色菌、限制馬拉色菌)靶DNA,其中馬拉色菌屬特異性引物根據馬拉色菌屬26S rRNA序列保守區域設計,后兩對種特異性引物則來源于rRNA的ITS2區。2012年,Zhang等[22]在此基礎上又設計了斯洛菲馬拉色菌種特異性引物及對應的TaqMan熒光探針。由于采用絕對定量法,以馬拉色菌標準株重組質粒構建標準品制作標準曲線,該方法檢測馬拉色菌DNA的靈敏度達到10拷貝,將研究引入更深層次,已應用到花斑糠疹、脂溢性皮炎等馬拉色菌相關疾病[11，23]及皮膚微生態研究中[22，24]。

四、花斑糠疹馬拉色菌臨床鑒定研究

花斑糠疹是由馬拉色菌所致皮膚角質層淺表感染,在各種馬拉色菌相關疾病中,對花斑糠疹的微生態研究開展得較早也最多。既往采用依賴于培養的鑒定方法,可能由于取樣方法或取樣量不同,不同研究間通過培養得到的馬拉色菌生長效率差別很大,在多項研究中皮損部位主要檢測結果為球形、合軸和糠秕馬拉色菌,限制馬拉色菌的檢出率很低甚至檢測不到。

基于分子生物學技術、不依賴培養的馬拉色菌鑒定分析方法的引入,使菌種檢測靈敏度顯著提高,限制馬拉色菌的檢出率發生了顯著變化:傳統培養生化鑒定法僅為0～8.0%,非培養分子生物學鑒定法則為100%。采用非培養法進行巢式PCR,Nakabayashi等[25]發現,花斑糠疹皮損中球形馬拉色菌比例為97%,其次是限制馬拉色菌(79%)和合軸馬拉色菌(68%)。Morishita等[18]從93.9%的花斑糠疹患者皮損區分別檢測出球形馬拉色菌及限制馬拉色菌,而其他菌種的檢出率低于35%。Saad等[23]采用TaqMan探針實時熒光PCR方法檢測發現,馬拉色菌定植量花斑糠疹皮損區是非皮損區的2.7～6.0倍;球形馬拉色菌的定植量在花斑糠疹皮損部位最高,限制馬拉色菌在非皮損部位最高,而對于健康個體,球形馬拉色菌和限制馬拉色菌無顯著差異,二者總和占馬拉色菌總量的95%以上,均為優勢菌種。Vuran等[26]從55例土耳其花斑糠疹患者皮損區刮取皮屑后直接提取馬拉色菌DNA,采用多重PCR方法檢測出其中50例為球形馬拉色菌。這些結果使球形馬拉色菌是花斑糠疹皮損的優勢菌種這個結論得到共識。

五、展望

盡管馬拉色菌培養操作復雜,保存不易,球形和限制馬拉色菌的流行病學數據資料有限,馬拉色菌屬種間異型性仍不斷被研究,從臨床樣本中直接檢測馬拉色菌DNA的方法成為準確鑒定馬拉色菌有力工具。菌種分類的日益完善和不依賴培養的分子生物學鑒定方法使馬拉色菌與皮膚微生態研究不斷發展,相關疾病的研究也更加深入。目前,球形馬拉色菌和限制馬拉色菌的基因組已測序并被分析[27-28],數字化的PCR技術[29]和高通量測序技術[6]也已廣泛應用于臨床科研。相信不久以后,通過非培養技術收集更多的mRNA基因數據進行基因組學蛋白組學研究,對致病菌株分離鑒定進行大規模流行病學調查,精確分析鑒定皮膚上共生的每一種馬拉色菌及其他微生物將成為現實。

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2014-03-24)

(本文編輯:顏艷)

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.025

610041成都,四川大學華西醫院皮膚科[尹斌(現在成都市第二人民醫院皮膚科,610017)、冉玉平]

冉玉平,Email:ranyuping@gmail.com