兒童肺炎支原體檢測方法的研究進展

業(yè)曉青

（南京市江寧醫(yī)院兒科，江蘇南京211100）

兒童肺炎支原體檢測方法的研究進展

業(yè)曉青

（南京市江寧醫(yī)院兒科，江蘇南京211100）

呼吸道感染是臨床常見疾病，病死率高，WHO2008年公布低收入國家下呼吸道感染病死率達11.2%，排十大疾病死因第一位，中高收入國家，病死率為3.8%，位居十大疾病死因的第四位［1］。支原體肺炎是機體感染肺炎支原體而引起的肺部炎癥，近年支原體肺炎的發(fā)病率出現(xiàn)逐年遞增趨勢［2］。肺炎支原體是常見的引起兒童呼吸道感染的病原體之一［3］，導致兒童社區(qū)獲得性肺炎（CAP）［45］。肺炎支原體引起的兒童肺炎病例在小兒呼吸道感染疾病中超過30%，發(fā)病有局部流行特點。由于初期臨床表現(xiàn)為非特異性癥狀，不易鑒別而被忽視造成累及多系統(tǒng)、器官損害的并發(fā)癥，嚴重影響患兒生命健康。實驗室指標檢查是診斷衣原體感染的可靠依據。為加深對肺炎支原體的認識，現(xiàn)將兒童肺炎支原體臨床檢測的研究進展作一綜述。

1 肺炎支原體

支原體（Mycoplasma）是介于病毒和細菌之間的可以在無生命人工培養(yǎng)基中繁殖培養(yǎng)的一類缺少合成肽多糖基因的原核微生物，由蛋白質和脂質組成三層結構，中間層是脂質，內外兩層是蛋白質，形成有分支的長絲，故于1967年稱之支原體，直徑0.2－0.3mm，極少超過1.0mm［6］。支原體廣泛存在于自然界，有60余種，有的支原體細胞膜外由多聚糖構成有毒性的莢膜，是支原體的致病因素。對人致病的支原體有人型支原體、肺炎支原體、穿透支原體及解脲支原體［7］。肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是Nocard和Roux于1898年首次從牛的肺組織中分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的病原體［8］，1941年首次在非典型肺炎病人體內發(fā)現(xiàn)肺炎支原體［9］，無細胞壁，存在于病人的鼻腔、口腔和氣管粘膜，人與人之間經飛沫或氣溶膠傳播，潛伏期一般為1－3周，5－15歲兒童易感染，主要表現(xiàn)為上呼吸道感染、氣管支氣管炎以及非典型肺炎，無地區(qū)分布特點，以溫帶地區(qū)常見［10］。美國文獻報道顯示肺炎支原體感染率介于2%－35%，有周期性特點，每隔4－7年有一次流行，5－9歲兒童感染肺炎支原體后發(fā)展為肺炎的機會遠遠高于15－19歲青少年［11］。我國徐作軍對肺炎支原體流行病學特點的有一完整描述：肺炎支原體全球范圍存在，一般為散發(fā)，3－6年可發(fā)生地區(qū)流行，人群密集地區(qū)集中發(fā)病；我國肺炎支原體引起的肺炎發(fā)病率高于國外地區(qū)；在中國，肺炎支原體肺炎有季節(jié)性特點，秋冬季發(fā)病率高；青壯年多發(fā)肺炎支原體肺炎［12］。國內研究結果發(fā)現(xiàn)，散發(fā)年份，肺炎支原體感染是兒童肺炎病原的10%－20%，流行年則可達到30%以上［13］。

2 發(fā)病機理及臨床表現(xiàn)

肺炎支原體主要侵犯人體呼吸系統(tǒng)，病理表現(xiàn)間質性或局灶性肺炎，常位于右肺下葉，累及多肺葉和胸膜，引起咽炎、氣管炎、支氣管炎和肺炎［14］。

肺炎支原體感染引起的兒童肺炎大部分為5－15歲的少年，偶然可能會在5歲以下兒童中發(fā)生。患兒初期癥狀不明顯，2－3周后癥狀加重，表現(xiàn)為干咳、嚴重者伴有喘息和呼吸困難，少數(shù)患病兒童肺炎發(fā)展迅速，發(fā)生呼吸衰竭或急性呼吸窘迫綜合征而死亡［15］。另有研究報道，肺炎支原體感染也許是哮喘發(fā)生、發(fā)展的風險因素。考慮肺炎兒童自身對肺炎支原體來說是敏感人群，肺炎支原體具備促進呼吸道炎癥，加重哮喘癥狀以及延長其病程［16－17］。

3 實驗室檢測

肺炎支原體感染的肺炎近年發(fā)病率持續(xù)升高，耐藥性不斷增加，探討早期、快速檢測肺炎支原體方法非常重要。臨床檢測肺炎支原體的方法有培養(yǎng)法、血清學檢測和分子生物學技術。目前普遍采用的肺炎支原體分離培養(yǎng)與血清學方法敏感性差，特異度低，試驗時間長，常出現(xiàn)假陰性結果。PCR診斷技術具有較高的靈敏度和特異度，為建立可靠快速的肺炎支原體早期檢測提供了可能。

3.1 培養(yǎng)法

采集臨床疑似患兒的咽拭子、痰、胸腔積液和肺泡沖洗液做標本，選擇疑似菌落超高倍顯微鏡做肺炎支原體活體檢測。肺炎支原體分離培養(yǎng)是檢測病原體的方法之一，方法操作簡單，但臨床標本的病原體含量少，分離培養(yǎng)時間耗時長，一般為3－4周時間，陽性結果靈敏度低，早期診斷價值小［18］。

3.2 血清學檢測

血清學檢測是臨床常用作診斷肺炎支原體感染的方法之一，包括抗原檢測和抗體檢測兩類方法。抗原檢測法主要包括直接免疫熒光法、對流免疫電泳法、蛋白質印跡法和抗原捕獲酶聯(lián)免疫分析方法；抗體檢測方法中的酶聯(lián)免疫吸附試驗和明膠顆粒凝集試驗方法應用廣泛。相對于抗體檢測肺炎支原體感染，抗原檢測方法靈敏度低，容易與呼吸道其他支原體出現(xiàn)交叉反應，臨床應用受限，故臨床抗體檢測應用普遍［19］。目前臨床研究進展顯示血清學特異性抗體檢測是診斷肺炎衣原體感染的主要手段［20］。現(xiàn)介紹幾種臨床常用的血清學檢測方法。

3.2.1 血清冷凝集試驗（Cold agglutination test，CAT） 是肺炎支原體感染時最早的一種體液反應，一般發(fā)生在感染肺炎支原體的一周后期或第二周前期，血清冷凝集效價升高。臨床常作為診斷肺炎支原體感染的傳統(tǒng)血清學檢測方法，因為操作方法簡單，基層醫(yī)院可作為有參考價值的診斷方法。但該方法的靈敏度和特異度不高，不能作為肺炎支原體感染的確診指標［21－22］。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Immunoassay，ELISAFA法） 上世紀80年代發(fā)明，常用作肺炎支原體抗體檢測。原理是采用吸附于載體表面的抗原，與血清中的相應抗體結合形成免疫復合物，與酶標記的第二抗體結合發(fā)生免疫反應，借助酶的降解作用顯示的不同顏色作出診斷。該方法試驗過程需要1小時，對實驗室條件沒有養(yǎng)要求，臨床較容易開展。缺點就是檢測結果受年齡、疾病病程，機體免疫功能及試劑盒不同等方面的影響，故不能對肺炎支原體早期診斷提供有力依據［23－24］。

3.2.3 明膠顆粒凝集法（PA） 將待檢標本血清稀釋，加入明膠致敏顆粒混勻，檢測其結果。該試驗方法操作簡單、方便快捷，血清抗體特異度高，無假陽性結果，符合率高，是臨床早期診斷衣原體肺炎感染的特異性方法之一，是支原體肺炎實驗室診斷的常規(guī)檢測方法［25］。

3.2.4 血清學檢測結果不能避免患兒的假陽性和假陰性問題，感染肺炎支原體肺炎的兒童，臨床治療治愈后體內仍存有一定強度的抗體滴度，接受抗體檢測時會出現(xiàn)假陽性；或者免疫缺陷不產生抗體的患兒，或免疫力低下的兒童自身抗體滴度低，檢測結果出現(xiàn)假陰性而失去臨床治療的機會［2627］。所以對于免疫系統(tǒng)發(fā)育未成熟或存在免疫缺陷的兒童病例，血清學檢測有一定的局限性。

3.3 分子生物學診斷技術

1985年PCR診斷技術問世以來，廣泛應用于生物學的各領域［28］。該診斷技術的標本采集及培養(yǎng)的過程大概需要2個小時，能夠檢測出患兒咽喉分泌物里的支原體DNA，文獻報道采用PCR技術檢測標本中的肺炎支原體，140例標本中30例標本PCR試驗陽性，其中21例肺炎支原體抗體陰性，有較高的靈敏度，并且實驗時間短［26］，檢測病原體表現(xiàn)出的快速簡單，靈敏度、特異度高的優(yōu)點，遠遠強于其他檢測方法，具有較高的臨床價值，可作為早期診斷肺炎支原體感染的方法［29］。張曉波等采用熒光定量法PCR技術檢測肺炎支原體，發(fā)現(xiàn)該方法針對免疫系統(tǒng)發(fā)育未成熟的患兒具有一定診斷價值，但是單獨診斷的準確率低于血清學檢測結果［3032］。如果從鼻咽、口咽處同時取標本做PCR檢測，診斷結果更可靠［33］。帶痰患兒的痰標本PCR陽性率高于鼻咽標本的PCR陽性率，臨床診斷下呼吸道感染情況更敏感［34］。但是PCR診斷技術操作復雜，所使用的一起設備較昂貴，基層醫(yī)院和一般實驗室開展不了該技術工作。

4 展望

綜上所述，肺炎支原體感染診斷方法很多，并各有其優(yōu)點和不足。臨床選擇合適的實驗檢測方法，能夠早期快速診斷肺炎支原體感染，及時提供準確的治療方案，減少并發(fā)癥及耐藥菌的產生。目前臨床針對患者癥狀體征和具體用藥方案選擇PCR生物技術聯(lián)合血清學方法檢測肺炎支原體是較可靠的診斷方法。專家學者也在不斷研究新的肺炎支原體感染診斷檢測方法，隨著科學技術的發(fā)展，進一步加深了解肺炎支原體發(fā)病機理和耐藥機制，不斷更新檢測技術，肺炎支原體的實驗室檢測方法將會具備更加早期、快速，特異性強、高效的特色。

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業(yè)曉青（1969－），女，江蘇人，本科，副主任醫(yī)師，長期從事兒內科的研究臨床工作。

2013－11－14）

1007－4287（2014）10－1729－03