TLR4在心血管疾病中的研究進展

張麗楠 張邢煒

●綜 述

TLR4在心血管疾病中的研究進展

張麗楠 張邢煒

心血管疾病是包括心肌及血管疾病的總稱，是威脅人類健康的重大疾病類別之一。不斷深入的研究發現，大部分心血管疾病的發生、發展都有免疫反應的參與。TOLL樣受體4（TLR4）作為天然免疫受體家族——TOLL樣受體（TLRs）家族的成員之一，與許多疾病的發生、發展密切相關，成為當前的研究熱點。本文對TLR4在部分心血管疾病的發生、發展過程中的作用及其機制的相關研究進展予以綜述。

1 TLRs家族

機體的免疫機制主要包括天然免疫和后天免疫。天然免疫是在個體出生時即具備，作用范圍廣泛，不針對特定抗原的免疫能力，所以也稱非特異性免疫。天然免疫在機體防御機制中具有重要作用，是抵抗病原微生物感染的第一道防線，因此天然免疫曾一度被人們認為是機體對外界刺激的一種低等應答。然而隨著對免疫機制研究的不斷深入，天然免疫的重要性日益凸顯。TLRs家族既是先天性免疫應答中重要的跨膜受體和信號轉導受體，也是觸發先天免疫和獲得性免疫應答的關鍵分子，目前成為研究的熱點。人TLRs最早發現于1997年，后為之命名為TLR4。隨著研究的不斷進展，迄今為止，在人體中至少已經發現了11個TLRs家族成員，分別為TLR1～TLR10、TLR14，它們主要表達于免疫相關細胞，包括單核細胞、樹突狀細胞，也可見于成纖維細胞、肥大細胞和多種組織器官（腎小管、呼吸道、心臟等）的上皮細胞；在亞細胞結構，人TLRs主要分為表達于細胞膜的TLR1、TLR2、TLR4～6、TLR11和表達于線粒體內的TLR3、TLR7～9兩大類[1]。TLRs主要包括富含亮氨酸的重復序列（LRR）的胞外區、富含半胱氨酸結構域的穿膜區以及TOLL/IL-1R同源結構的胞內區3部分。正是這種特殊結構使其識別的信號易于進一步轉導，同時也意味著任意區域的缺失突變都會導致信號轉導的異常。

研究發現，TLRs是一類廣泛分布于細胞表面的跨膜蛋白，屬于表面模式識別受體（PRR），因其與成員的胞外區的同源性略有差異，因此可以識別多種不同的內源性及外源性配體[2]。包括通過識別病原相關分子模式（PAMPs）[3]來激活固有性免疫系統的肽聚糖（PGN）、細菌脂蛋白、合成的聚肌胞苷酸poly、鞭毛蛋白、病毒單鏈RNA（ssRNA）等，也包括通過損傷相關分子模式（DAMPs）[4]識別的熱休克蛋白（HSP）、細胞外基質的降解產物、自身的核酸成分等。TLRs的信號轉導特點與炎癥和免疫反應有關，TLRs識別受體后，可傳遞給細胞內的接頭分子髓樣分化蛋白88（MyD88）、MyD88轉接樣蛋白（Mal）和TRIF相關的接頭分子（TRAM）。這些分子可以通過激活炎癥的主要調節物核轉錄因子κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和β干擾素（IFN-β），引起多種細胞因子釋放，上調抗原提呈細胞（APCs）、表面CD80（B7-1）、CD86（B7-2）等共刺激分子，并最終激活特異性免疫系統，產生細胞保護作用[5]。

2 TLR4

TLR4是TLRs中最先被發現的成員，因其在炎癥反應、腫瘤、心血管疾病、自身免疫的發生、發展中扮演了重要的角色，已成為免疫機制研究中的熱點。TLR4主要表達于細胞膜，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，位于9q32-33，其cDNA長度約為3811bp，包含879個氨基酸。同家族中其他成員一樣，TLR4也由三個部分組成：胞外區是由24個富含亮氨酸的重復序列組成；胞內區約含有200個氨基酸殘基，由TOLL同源結構域和分子羧基端長短不同的短尾肽組成，該區域是TLR4與其下游相關的信號轉導分子，如MyD88、IL-1相關蛋白激酶（IRAK）、腫瘤壞死因子受體活化因子6（TRAF-6）和蛋白激酶等相互作用的關鍵部位；跨膜區具體組成尚不明確。TLR4在人體內分布范圍廣泛，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、肥大細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、小腸上皮細胞、呼吸道上皮細胞、表皮微血管、臍靜脈內皮細胞、人成牙齦纖維細胞、子宮平滑肌細胞、心肌細胞等。TLR4除以革蘭陰性細菌的細胞壁成分內毒素（LPS）為主要配體外，還可識別包括紫杉醇、呼吸道合胞體病毒蛋白F（RSF）、HSP60、假單胞菌屬LPS等[6]。

3 TLR4介導信號通路

TLRs信號轉導通路在免疫調節中發揮重要作用，根據信號傳遞過程分為細胞外傳遞和細胞內傳遞。細胞外傳遞主要是通過內毒素結合蛋白（LBP）將LPS從細菌外膜上轉移下來,并與其脂質A結合，通過形成LPSLBP復合物，與可溶性CD14（sCD14）結合，并形成由這3者構成的復合物。將復合物中的LPS傳遞給膜結合CD14（mCD14），再由mCD14將LPS傳遞給TLR4。Akira等[7]研究表明LPS結合MD-2后,通過TLR4的細胞外富含亮氨酸的重復結構介導TLR4的聚合,從而誘導TLR4完成細胞外信號轉導。同時,LBP和CD14將LPS交給高密度脂蛋白顆粒,促進其清除。細胞內途徑則依據早期有無MyD88參與分為MyD88依賴性信號轉導通路和MyD88非依賴性信號轉導通路。兩條通路最終都激活NF-κB，以誘導靶基因（主要是炎性細胞因子、化學趨化因子）的轉錄、翻譯，使炎性細胞因子大量表達，導致機體組織、器官的損害。MyD88依賴性通路主要介導炎性細胞因子產生；MyD88非依賴性通路主要促進LPS誘導的IFN誘導性蛋白-10、糖皮質激素終止反應基因-16、INF調節基因-1（INF-1）的表達和樹突狀細胞成熟[8]。

3.1 MyD88依賴性信號轉導路徑 MyD88分子質量為35kU，具有兩個特殊的結構區域，即N端死亡域和C端TIR結構域。通過TIR結構域與TLR4發生關聯、通過DD結構域與IRAK發生關聯。同時當MyD88被募集到TLR4后,通過TIR和DD結構域形成同源二聚體。因此MyD88的功能是作為轉接蛋白連接TLR4和其下游含有DD結構域的信號分子。MyD88介導的信號轉導過程是在完成細胞外轉導后，誘導TLR-4/MD2異二聚化，使MyD88和MAL聚集到TLR4受體復合體。IRAK-1和IRAK4與該受體復合物結合后，首先引起IRAK-4的磷酸化，隨后為IRAK-1磷酸化，使其從受體復合體上解離，并與TRAF-6相互作用，從而誘導AP21轉錄因子的激活或進一步使轉錄因子NF-κB遷移到細胞核內，引起相關基因的轉錄。通過上述信號轉導途徑, TLR4介導轉錄因子的活化,誘導靶基因的轉錄,介導早期的天然免疫反應。

3.2 MyD88非依賴性信號轉導路徑 隨著研究的不斷深入，Akira等[7]首先發現TLR4的信號轉導不只有MyD88依賴性通路,還存在MyD88非依賴通路。MyD88同源蛋白是含TIR結構域的銜接蛋白（TIRAP），又稱Ma l，包括含TLR樣受體相關的干擾素活化子（TRIF），含TIR結構域的接頭分子-1（TICAM-1）及TRA，由這些蛋白介導了MyD88非依賴性信號轉導通路。MyD88非依賴性通路主要是通過活化干擾素調節因子3（IRF3）和NF-κB來釋放INF-1和各種炎癥因子。TRIF通過TRAF3激活催化IRF3的磷酸化和誘導其核異位，而激活后的IRF3能誘導INF1的表達，且能促使各型干擾素的基因表達；同時TRIF通過TRAF6和受體相互作用蛋白1（RIP1），激活轉化生長因子激活激酶（TAK1），通過與MyO88依賴性通路類似的途徑激活NF-κB和MAPKs，最終促使炎性細胞因子的產生和釋放。

4 TLR4與心血管疾病

心血管疾病為臨床常見病種，自1990年以來持續成為我國居民首位死亡原因，根據2006年和2008年衛生部衛生統計信息中心發布的數據，我國心血管病病死率分別為183.7/10萬和241.0/10萬，占當年死亡構成比的34.8%和40.27%，病死率有逐年增高趨勢[9]。不斷深入的研究發現，動脈粥樣硬化、高血壓等非感染性心血管疾病的發生、發展均與氧化應激和炎癥反應有著密切關系。TLR4在動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、心肌炎等心血管疾病的發生、發展過程中發揮了重要作用。

4.1 TLR4與動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化是與多種危險因素如高血壓、糖尿病、吸煙等相關的動脈慢性炎癥性疾病，多種因素在其發生、發展過程中起重要作用。動脈粥樣硬化最早表現為血管內皮細胞功能障礙，導致血管壁完整性被破壞[10]。而血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞的損傷以及樹突狀細胞、單核巨噬細胞等免疫細胞分泌炎癥因子與TLR特別是TLR2和TLR4密切相關，在動脈粥樣斑塊的形成和發展中發揮重要作用。人類動脈粥樣硬化斑塊表面高度表達TLR1、TLR2、TLR4及激活的NF-κB[11]。TLR表達水平的增加引起細胞激活和促炎癥級聯反應的激活。Michelsen等研究發現，TLR4/ApoE雙敲除的小鼠比ApoE敲除的小鼠動脈粥樣硬化的發生率低，且內膜損傷程度也低于MyD88/ ApoE雙敲除的小鼠。但在TLR4/ApoE和MyD88/ApoE雙敲除的小鼠中，其抗動脈粥樣硬化的作用與膽固醇水平無明顯相關性。同時，在TLR4/ApoE和MyD88/ApoE雙敲除的小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的脂質和巨噬細胞也顯著降低，這說明TLR4信號通路在動脈粥樣斑塊的發生、發展中和斑塊穩定性中起著至關重要的作用。正常情況下TLR4在人主動脈內皮上表達很少，然而在動脈粥樣硬化早期，TLR4表達水平即明顯增高。He等[12]研究發現，LPS通過調節TLR4信號通路引起內皮祖細胞（EPCs）增殖，維持其干細胞表型，并參與動脈粥樣硬化早期損傷修復。動脈粥樣硬化血管壁的中膜平滑肌細胞中TLR4表達增加，參與調節平滑肌的增殖，而血管平滑肌細胞（VSMCs）在調節血管厚度，與新內膜的形成過程中發揮重要作用。隨著病變進展，大多數沉積的脂類來自于血漿中的低密度脂蛋白（LDL），它們利用內皮損傷或功能失常而進入血管壁。Midwood等[13]在動脈粥樣硬化斑塊中發現TLR4配體結合腕蛋白C。Cole等[14]在動物模型研究中指出，輕度修飾的低密度脂蛋白（mmLDL）是一種促進具有致動脈粥樣硬化潛力的促炎癥因子與趨化因子分泌的強烈誘導劑，作為內源性配體可激活TLR4信號途徑，加速動脈粥樣硬化病變的發展。Hayashi等[15]在研究中發現，感染牙齦卟啉單胞菌的TLR4/ApoE雙敲除的小鼠較單純ApoE缺陷小鼠更易形成動脈粥樣硬化，通過活體成像技術可以發現隨著年齡的增長病變發生及進展逐步增強，證明了TLR4在慢性炎癥與動脈粥樣硬化的進展中起到重要的作用。Lu[16]通過使用TLR4拮抗劑球形紅桿菌脂多糖作用于糖尿病ApoE缺陷小鼠和非糖尿病ApoE缺陷小鼠，發現TLR4拮抗劑可以抑制糖尿病ApoE缺陷小鼠血管炎癥及動脈粥樣硬化進展，亦可降低非糖尿病ApoE缺陷小鼠血清膽固醇及甘油三酯水平。因此，在血脂代謝紊亂和慢性炎癥相互作用下，TLR4在動脈粥樣硬化發生、發展中可能起著重要的橋梁作用。

4.2 TLR4與高血壓 高血壓是常見的心血管疾病，其發生和發展是其靶器官如心臟、腎臟、血管的結構和功能的損傷過程，對于高血壓的發生機制，除遺傳、精神、神經作用外還包括血管、體液調節等因素的影響。腎素-血管緊張素-醛固酮系統平衡失調即為高血壓發生的重要因素之一，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是該系統中的重要活化部分，而AngⅡ本身不僅是一種促炎癥介質，還可作為一種內在的氧化劑，促使氧化應激的發生。康曉敏等[17]將野生型C57小鼠隨機分為對照組、AngⅡ組和TLR4組。對AngⅡ組小鼠進行TLR4中和抗體注射。結果顯示與對照組比較，AngⅡ組小鼠血壓及部分相關炎癥指標表達明顯下調，與AngⅡ組比較，TLR4組小鼠血壓及部分相關炎癥指標表達明顯下調，進一步說明TLR4通過介導炎性反應參與AngⅡ所致高血壓小鼠血管重構。從而為TLR4參與AngⅡ所致的高血壓小鼠血管重構提供了直接的證據。Marketou等[18]通過將43例非糖尿病高血壓患者隨機分為降壓標準治療組與強化治療組，并將16例正常人設為正常對照組，分別比較治療前后各組TLR4基因在外周血單核細胞表達情況，研究顯示，進行治療前高血壓患者的TLR4 mRNA水平明顯高于正常對照組。治療12周后，與標準治療組相比，強化治療組TLR4 mRNA表達水平顯著下調。由此亦可以推斷，TLR4與高血壓存在相關性。

4.3 TLR4與心力衰竭 幾乎所有的心血管疾病發展到終末階段都會導致心力衰竭，而且心力衰竭的發生往往不是單一病因所致，更重要的是有多種神經體液因子參與。感染作為心力衰竭的首要誘因，明確了炎癥與心力衰竭的相關性。1990年首次提出了心力衰竭與炎癥的關系，陳穎等[19]將90例老年慢性左心衰竭患者與健康對照者外周血EMP62E、TLR2、TLR4水平比較，老年慢性左心衰竭患者3者表達均增高，且與患者心力衰竭程度呈正相關。而對于TLR4促使心力衰竭發展的機制考慮氧化應激激活內皮表面附著的中性粒細胞,釋放炎性蛋白S-100A12并與內皮細胞表面晚期糖基化終末產物受體相互作用,通過MAPKs和NF-κB信號通路，導致內皮細胞損傷[20]。而TLR4可促使NF-κB表達,活化NF-κB信號通路,導致心肌缺血和心肌細胞收縮功能失調。同時TLR4信號轉導通路還可通過共同的下游銜接蛋白MyD88，導致內皮損害更加嚴重,使老年慢性左心衰竭進一步惡化。Ogawa等[21]將小鼠的左冠狀動脈結扎，造成急性大面積心肌梗死和慢性心力衰竭模型，檢測相關指標發現，心力衰竭小鼠腦干相對于假手術組TLR4的表達明顯增高。以上研究均可說明，TLR4及其介導產生的炎性因子在慢性心力衰竭的進展過程中起著重要作用。

4.4 TLR4與心肌炎 心肌炎是各種感染、免疫介導損傷以及中毒等所引起的心肌細胞炎癥過程。病毒性心肌炎（VMC）是我國最常見的心肌炎，隨著病情的進展，有一部分可發展為擴張型心肌病（DCM）。在呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒導致的病毒性心肌炎中，一系列炎性因子是由TLR4介導產生的，TLR4通過增加病毒復制以及影響細胞因子的產生，加重心肌炎癥、引起心肌細胞肥厚和壞死，從而影響VMC和DCM的發生、發展和預后。Li等[22]在通過柯薩奇病毒B3感染正常Balb/c小鼠過程中發現，隨時間推移模型組心臟組織病理評分明顯高于對照組，模型組心肌膠原容積分數在28d顯著高于對照組在各個時間點并高于本組7d和14d時間點。在各時間點,模型組的肥大細胞數量及TLR4的表達與對照組相比顯著增高，且心臟肥大細胞數量與TLR4mRNA表達在所有時間點呈正相關。由此推斷肥大細胞和TLR4在VMC的炎癥反應和纖維化過程中扮演了重要角色。DingY等[23]用柯薩奇病毒B3建立病毒性心肌炎小鼠模型，并用肉桂油進行干預，發現干預小鼠的死亡率、心肌iNOS、TNF-α、NF-κB p65和TLR4的表達較模型組低，并指出肉桂醛在治療病毒性心肌炎重要通過其代謝產物肉桂酸抑制TLR4-NF-κB信號通路。周欣等[24]指出通過抑制TLR4mRNA及NF-κB在病毒性心肌炎中的表達，減輕心肌損傷。在VMC后期心肌成纖維細胞的數目增多，而成纖維細胞表面也有TLR4的表達，可以認為是VMC后期TLR4增加原因之一[25]。Ehrentraut等[26]研究發現，應用TLR4拮抗劑可通過減少炎癥因子以及增加抗炎細胞因子，控制心肌肥厚的進展，減輕心肌肥厚。Jenke等[27]發現在免疫性心肌炎中通過抑制TLR4信號通路可有效地減緩心肌免疫細胞活動，延緩炎癥進展。雖然TLR4信號通路在心肌炎中起重要作用，但有關其在心肌炎中的作用的研究結果不盡一致，近年也有研究報道脂多糖誘導激活TLR4，可減少心肌細胞凋亡，從而改善存活心肌細胞功能。因此對于更詳盡的機制有待更加深入研究。

綜上所述，TLR4作為晚近發現的免疫反應中關鍵分子的TLRs家族成員，在部分心血管疾病的發生、發展過程中發揮了重要作用。隨著研究的不斷深入，TLR4很可能成為心血管疾病防治的新的靶點。雖然人們對TLR4已經有較為全面和深入的認識,但其在某些疾病中的作用機制仍有待進一步闡明。隨著科技的不斷進步，研究的不斷深入，以及針對TLR4為靶點的藥物與疫苗的研制、開發，TLR4在心血管疾病的臨床診斷治療及判斷預后等方面都將取得突破性的進展。

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2013-09-16）

（本文編輯：馬雯娜）

310015 杭州師范大學附屬醫院心內科

張邢煒，E-mail：xwzhang@medmail.com.cn