抗核抗體復篩查試驗陰性與特異性抗體確認試驗陽性的關聯

[摘要] 目的 探討抗核抗體（ANA）復篩查試驗陰性與特異性抗體確認試驗陽性的關聯。 方法 對2065例間接免疫熒光法（IIF）檢測陰性結果的樣本進行免疫印跡法（LIA）檢測，并使用ELISA進行輔助檢測。觀察IIF陰性結果下LIA、ELISA檢測結果，并對樣本稀釋度對結果的影響進行深入研究。 結果 165例IIF陰性樣本經LIA確認為陽性，其中以SS-A最多，達到29.76%。通過ELISA檢測SS-A，發現與LIA符合率達到88.0%；而通過降低樣本稀釋度，可以發現50%的樣本是因為特異性抗體的濃度較低才漏檢的。 結論 對于高度懷疑為AID的患者，不管IIF檢測是否為陽性，都應該進行LIA的復檢，以提高檢測的準確性。

[關鍵詞] 抗核抗體；特異性抗體；間接免疫熒光法；免疫印跡法

[中圖分類號] R446.6 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）20-0070-03

抗核抗體（ANA）檢測是目前臨床上診斷自身免疫性疾病（AID）最重要、可靠的一種實驗室診斷手段，其中間接免疫熒光法（IIF）的使用最為廣泛[1，2]。隨著實驗技術的進一步發展，目前其他針對特異性抗體（ANAs）的新型檢查手段也不斷出現，如ELISA、免疫擴散及免疫印跡等[3，4]。臨床工作中，IIF常常作為初步檢測存在，對檢測結果呈現陽性的樣本進行特異性抗體確認試驗[5]。但臨床工作中發現，有時IIF與特異性抗體確認試驗結果差異較大。我科對2 065份IIF檢測陰性樣本進行免疫印跡法（LIA）檢查，共發現15種特異性抗體。本研究試圖闡述IIF陰性樣本與LIA檢查的關系與意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究共納入受試者2 065例，均為我院2010年1月～2012年12月各科室申請ANA檢測的患者，ANA檢測均采用IIF，檢測結果均為陰性。其中男972例，女1 093例，年齡37～69歲，平均（52.1±13.3）歲。患者均為清晨空腹抽取肘靜脈血液5 mL，血液經離心機離心5 min，轉速3 000 r/min，分離出血清。

1.2 IIF檢測

IIF檢測試劑盒購自德國歐蒙公司，將分離出的血清稀釋，并使其與抗原基質片反應，時間為30 min（同時設陽性和陰性對照），浸泡5 min，然后加入熒光標記的二抗，避光孵育30 min，浸泡5 min。最后用甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察并記錄結果，陽性結果為抗體滴度≥1∶100。

1.3 LIA檢測

LIA檢測試劑購自德國歐蒙公司，特異性抗體檢測包括抗nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、著絲點蛋白B（CENP B）、增殖細胞核抗原（PCNA）、雙鏈DNA（dsDNA）、核小體（Nucleosome）、組蛋白（Histone）、核糖體（rRNP）以及線粒體-M2（AMA-M2）等15種。在第一次溫育時，將已經1∶100稀釋的血清樣本2 mL與膜條上的靶抗原反應，等待30 min后洗滌3次，共計15 min。之后加入抗人IgG（酶結合物，已經酶標記）1.5 mL反應，等待30 min后洗滌3次，共計15 min。最終加入底物液反應15 min，并用蒸餾水洗滌膜條，肉眼觀察反應結果。

1.4 ELISA定性檢測抗SS-A

試劑盒購自德國歐蒙公司，以20 RU/mL的吸光度（A）值為定性分析臨界值。標本1∶200稀釋，450 nm波長比色。

1.5 正常對照組

選取20份經IIF、LIA檢測均為陰性的血清樣本作為對照，稀釋度分別為1∶10、1∶32。

1.6 統計學方法

應用SPSS 14.0軟件，計數資料采用χ2檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IIF檢測陰性與LIA檢測

2 065例血清樣本，IIF檢測后均為ANA陰性。所有樣本經LIA檢測，2 065例樣本中，有165例為ANA陽性。

2.2 LIA特異性抗體檢測分析

我們對165例IIF檢測陰性、LIA檢測陽性的樣本進行特異性抗體檢測分析，發現包含15種不同的特異性抗體，見表1。

表1 LIA特異性抗體檢測分析

2.3 LIA檢測SS-A陽性標本與ELISA復檢分析

根據表1中的結果，可以發現SS-A的IIF檢測漏檢率最高，達到了29.76%。因此，將SS-A作為代表，進行進一步檢測。我們對經LIA檢測SS-A陽性血液樣本進行ELISA檢測，發現ELISA檢測后SS-A陽性例數為44例，一致性達到88.0%。見表2。

表2 LIA檢測SS-A陽性標本與ELISA復檢分析

2.4 血液樣本稀釋度與IIF檢測SS-A陽性分析

我們對初始樣本采用1∶100的稀釋比例，結果50例IIF檢測SS-A為陰性。因此，我們降低樣本的稀釋度，結果發現經過降低稀釋度后，有50%原本SS-A陰性的樣本呈現陽性結果，與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

表3 血液樣本稀釋度與IIF檢測SS-A陽性分析

注：*與對照組比較，P < 0.05

3 討論

抗核抗體（ANA）是一組將自身真核細胞的各種細胞核成分作為靶抗原的自身抗體的總稱，是目前自身免疫性疾病最常用的篩查指標，主要存在于血清中，也可在胸水、關節滑膜液和尿液中出現。抗核抗體在大多數自身免疫性疾病中均可呈陽性，如SLE、RA、混合型結締組織病、干燥綜合征、硬皮病、多發性肌炎等，因此，ANA檢測目前普遍應用于臨床診斷AID的工作當中，也是當前條件下確診疾病、提供治療的主要依據[6]。IIF曾作為臨床上自身抗體檢測的主要手段，由于其具有敏感性高、檢測方便以及能夠對細胞核、細胞漿、細胞骨架、細胞周期等自身抗體具有檢測范圍廣等優點，一直作為自身抗體檢測的“金標準”[7-9]。隨著臨床診療與檢查技術的發展，發現IIF檢查缺乏特異性，因此對于一些AID疾病的診斷上存在一定的漏誤診可能[10]。隨著研究的深入，目前實驗室研究已經發現并確認了許多細胞核靶抗原，相應的特異性檢查手段也越來越多[11]。目前實驗室檢測常用的有ELISA、免疫擴散以及免疫印跡等。LIA是近年來研究較多的一種檢測方法，研究表明[12]，LIA具有快速簡單、自動化操作等優點，而且結果迅速易讀。此外，LIA一次可以檢測AID相關的多種特異性自身抗體，對AID的診斷和鑒別診斷、病情評估與治療監測、病程轉歸與預后判斷等具有重要的臨床價值，且檢測的敏感度與準確性相對較高，與ELISA同樣有著極高的診斷作用[13]。在日常檢驗工作中，IIF常常作為AID疾病患者的初步診斷，但已有一些文獻顯示，IIF檢測的自身抗體與LIA檢測特異性抗體往往存在較大程度的差異[14，15]，因此本研究對IIF檢測陰性的血液樣本進行LIA特異性抗體檢測。通過對兩者不同結果進行分析，闡述該類標本檢測自身特異性抗體的臨床意義。

本研究發現，2 065例IIF檢測ANA陰性樣本，經過LIA檢測后165例為陽性結果。經過分析，我們發現，50例為SS-A的漏診，漏診比例明顯大于其他特異性抗體。因此，我們將SS-A作為代表進行了進一步研究。首先，我們采用ELISA對50例樣本進行ANA檢查。結果發現，ELISA檢查下44例為陽性結果，陽性率為88.0%。說明LIA與ELISA在檢測特異性抗體方面，具有較高的符合率。因此，我們將樣本的稀釋度改變并進行了IIF的重新檢測，結果發現在1∶10時，ANA陽性為17例，1∶32時，ANA陽性為8例，而1∶10時ANA陰性為25例。對照組中，1∶10時，ANA均為陰性。結果提示，50%的樣本是因為特異性抗體的濃度較低才漏檢的。

綜上所述，IIF檢測自身抗體能夠出現15種類型特異性自身抗體的漏檢，而其中以SS-A漏檢率最為嚴重（29.76%）。因此，對于高度懷疑為AID的患者，不管IIF檢測是否為陽性，都應該進行LIA的復檢，以提高檢測的準確性，為AID的臨床診斷提供實驗室診斷依據。

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（收稿日期：2013-05-13）