密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中成骨細胞和破骨細胞功能的影響*

武密山， 趙素芝， 任立中， 王 茹， 白 霞， 韓紅偉， 李 彬

(1河北醫科大學中醫學院方劑學教研室，河北 石家莊050091;2石家莊市橋東區勝北社區衛生服務中心，河北石家莊050041;3河北醫科大學第一醫院骨科，河北 石家莊050031;4 河北醫科大學生物化學教研室，河北 石家莊050017)

研究表明，密骨打老兒丸(Migu-Dalaoer pill，MDP)能抑制由去卵巢、雌激素缺乏引發的骨轉換增強，提高骨密度，糾正失衡的骨偶聯［1］。考慮到骨代謝是成骨細胞(osteoblast，OB)與破骨細胞(osteoclast，OC)共同生活在一起的整體，OB 和OC 間的信息交流是影響骨代謝調控的重要環節，二者之間的信息交流對彼此功能的影響是骨代謝的重要方面，用MDP 含藥血清對單純成骨細胞干預實驗并不能代表MDP 對骨代謝調控的真實情況，本實驗設計更符合骨代謝微環境的成骨-破骨細胞共育體系，并用MDP 含藥血清進行了干預，現將結果報告如下。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 清潔級10 月齡雌性SD 大鼠40 只，體重(351.36 ±12.35)g ，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為2011A018。普通級1 日齡SD新生大鼠，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為2011B025。

1.2 藥物 打老兒丸來源于《萬氏家抄方·卷四》，組成是:石菖蒲、干山藥、川牛膝、遠志、巴戟天、川續斷、五味子、楮實子、杜仲、山萸肉、茯神、熟地黃、小茴香、肉蓯蓉、枸杞子各等分。打老兒丸加上具有促進成骨作用的淫羊藿［2］、骨碎補［3］、補骨脂［4］、菟絲子各等分，按照參照文獻［1］，制備MDP，每1 mL 藥液含生藥5.5 g，相當于臨床用量的20 倍。

1.3 主要試劑 胰蛋白酶(Sigma)，collagenase typeⅡ(Worthington)，噻唑藍、堿性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)試劑盒(Wako);DMEM 培養基(Gibco)，胎牛血清(HyClone)，α-minimal essential medium(α-MEM，Gibco)，二甲基亞砜(DMSO)購自 Sigma Chemical Co，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)試劑盒(Sigma)，戊二醛、甲苯胺藍為E. Merck 產品。其余普通試劑均為分析純。

1.4 主要儀器 倒置相差顯微鏡(Olympus)，CO2恒溫培養箱(NuAire)，96 孔培養板(Costar)，35 mm 組織培養皿(Corning)，紫外可見分光光度計(HP 8453);低溫臺式離心機(IEC)，可調式移液器(Eppendorf)，全自動酶標儀(Biohit)，D-37520 型高速冷凍離心機(Beckman)，0.22 μm 針式濾器(Costar)，Leitz 1600 型鋸式切片機(Leica)，SB-3200D 超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，XDS-1B型倒置相差顯微鏡(重慶光學儀器廠)。

2 方法

2.1 大鼠血清的制備 40 只10 月齡大鼠，隨機分為2 組:(1)服藥組:按1 g·kg-1灌服MDP，每天1次，連續3 d;(2)對照組:只灌服相同體積的生理鹽水。第3 次灌胃1.5 h 后，所有大鼠均在乙醚麻醉下自腹主動脈抽取血液，同組合并后離心獲取血清，血清在56 ℃滅活30 min，0.22 μm 濾膜過濾除菌后備用。參照本實驗室方法［5］，制備0.1 μmol·L–1、1 μmol·L–1和10 μmol·L–1(低、中、高劑量)的MDP 含藥血清和生理鹽水對照血清。

2.2 骨片的制備 參照文獻［6］，將新鮮牛股骨用金剛砂片及粗細金鋼砂石制備成6 mm ×6 mm 大小，10 μm 厚的骨磨片，超聲清洗2 次，各10 min，置入含1 ×106U/L 青霉素和1 g/L 鏈霉素的D-Hanks 緩沖液中浸泡，換液3 次，每次20 min。

2.3 OB 的分離與培養 取孕齡22 d SD 大鼠1只，處死后無菌操作取出14 只胎鼠的顱骨，參考Brighton 等［7］介紹的分段膠原酶消化法進行成骨細胞的分離。

2.4 OC 的分離與培養 參照文獻［8］，應用改良Fenton 等的方法，由1 日齡SD 大鼠四肢長骨分離OC。

2.5 成骨- 破骨細胞共育體系的建立 參照文獻［9-10］，對96 孔細胞培養板進行改裝(圖1)。即在距培養孔底部2 mm 處打孔(直徑4 mm)，使相鄰的4 孔相通，中間加一層0.45 μm 的隔膜，膜與培養板接觸處用3%瓊脂糖凝膠密封，防止左右兩室的細胞混雜，但培養上清可以經過隔膜相通。將制備好的培養板置于紫外線燈下照射消毒，備用。將OB 以5×103密度接種到96 孔細胞培養板的OB 培養室，3 h 后細胞已牢固貼于孔底;在培養板的OC 培養室中加入密度為5 ×103的新分離的OC，30 min 后可見細胞沉入孔底;小心加入培養基，漫過通道孔，使兩側培養上清相通;每4 h 將培養板傾斜5 次，促進雙側上清交流。待細胞周期同步化后，按實驗要求進行培養。

Figure 1. Osteoblast and osteoclast co-culture system.圖1 成骨細胞－破骨細胞共育體系示意圖

2.6 血清干預方法與分組 待上述成骨-破骨細胞共育體系的細胞周期同步化后，實驗共分4 組，分別為:對照組(normal，加入相同質量濃度的對照大鼠血清)、MDP 含藥血清低劑量組(L-MDP，加入0. 1 μmol·L–1MDP 含藥血清)、MDP 含藥血清中劑量組(M-MDP，加入1 μmol·L–1MDP 含藥血清)和MDP 含藥血清高劑量組(H-MDP，加入10 μmol·L–1MDP 含藥血清)，不同濃度培養組，每組藥物濃度均設10 個平行孔，每孔加入相應DMEM 培養液200 μL 予以培養，每隔2 ～3 d 換液1 次。

2.7 MTT 法繪制OB 增殖生長曲線 將上述共育體系中OB 培養室的OB 分別于4、5、6、7 d 用0.25 g·L-1胰蛋白酶消化，1 ×108L-1接種于96 孔板，每天各取10 孔計數，每孔計數5 次，計算均值，連續4 d。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，描繪生長曲線。計算群體倍增時間(doubling time，TD):TD=t ×log2 /(logNt-logN0)，N0和Nt分別代表接種后和培養t h 的細胞數。

2.8 OB 內ALP 活性測定 將上述共育體系中OB培養室的OB 分別于4、5、6、7 d 進行ALP 檢測。方法如下:每天于同一時點取每個實驗組10 個復孔，吸盡培養液，PBS 溶液洗3 次，每孔加入0. 2 %Triton X-100 100 μL，振蕩30 min 后再加入反應液100 μL，37 ℃孵育30 min，最后每孔加入0.2 mol ·L-1NaOH 50 μL，終止反應，在酶標儀405 nm 波長下檢測各孔的吸光度，每組取樣本值的均數繪制各組ALP 隨時間變化的曲線。

2.9 OC 骨吸收陷窩的計數 在上述共育體系中OC 培養室中加入吸附OC 骨磨片，小心加入培養基，漫過通道孔，使兩側培養上清相通;每4 h 將培養板傾斜5 次，促進雙側上清交流。分別于4、5、6、7 d 計數每個骨磨片上吸收陷窩數目。方法如下:取出骨磨片，2.5% 戊二醛固定液中于4 ℃固定7 min ，然后在0.25% NH3·H2O 溶液中超聲清洗1 min，共3次，經系列乙醇脫水，自然晾干后，置甲苯胺藍染液中，室溫下染色3 ～4 min，蒸餾水清洗后于光鏡下對整張骨磨片上的吸收陷窩有專人盲法進行計數。

2.10 OC 內TRAP 活性檢測 將上述共育體系中OC 培養室的OC，分別于4、5、6、7 d 按照試劑盒說明進行TRAP 活性檢測。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean ±SD)表示。使用SPSS 11.5 統計軟件，用方差分析處理，組間比較用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OB 增殖的影響

與對照組相比，MDP 含藥血清低劑量組OB 的生長曲線無顯著差異(P ＞0. 05)。MDP 含藥血清中劑量組和高劑量組OB 的生長曲線在6 和7 d 與同一時段對照組相比較明顯升高(P ＜0.01 )，見圖2。

Figure 2. Effects of the serum containing MDP at different concentrations on osteoblast proliferation rate in osteoblast and osteoclast co-culture system at different time points. ＊＊P ＜0.01 vs normal.圖2 不同濃度密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OB 增殖的影響

2 密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OB ALP活性的影響

與對照組相比，MDP 含藥血清低劑量組OB 的ALP 活性無顯著差異(P ＞0. 05)。MDP 含藥血清中劑量組和高劑量組OB 的ALP 活性在6 和7 d 與同一時段對照組相比較明顯升高(P ＜0.01)，見圖3。

3 密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OC 骨吸收陷窩數目的影響

與對照組相比，MDP 含藥血清低劑量組OC 的骨吸收陷窩數目無顯著差異(P ＞0. 05)。MDP 含藥血清中劑量組和高劑量組OC 的骨吸收陷窩數目在6 和7 d 與同一時段對照組相比較明顯降低(P ＜0.01)，見圖4。

Figure 3. Effects of the serum containing MDP at different concentrations on ALP activity of osteoblasts in osteoblasts and osteoclast co-culture system at different time points. ＊＊P ＜0.01 vs normal.圖3 不同濃度密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OB 堿性磷酸酶活性的影響

Figure 4. Effects of the serum containing MDP at different concentrations on the number of osteoclast bone absorption lacuna in osteoblast and osteoclast co-culture system at different time points. ＊＊P ＜0.01 vs normal.圖4 不同濃度密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OC 骨吸收陷窩數目的影響

4 密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OC TRAP活性的影響

與對照組相比，MDP 含藥血清低劑量組OC 的TRAP 活性無顯著差異(P ＞0.05)。MDP 含藥血清中劑量組和高劑量組OC 的TRAP 活性在6 和7 d與同一時段對照組相比較明顯降低(P ＜0.01)，見圖5。

Figure 5. Effects of the serum containing MDP at different concentrations on TRAP activity of osteoclasts in osteoblasts and osteoclast co-culture system at different time points. ＊＊P ＜0.01 vs normal.圖5 不同濃度密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OCTRAP活性的影響

討 論

OB 不僅分泌骨基質參與骨形成，也參與OC 骨吸收功能的調節［11］。正常骨重建起始于OC 激活，OC 性骨吸收伴隨生命活動的始末，如果OC 異常活躍，可誘發骨質疏松癥。ALP 是OB 分化時所分泌的酶，是OB 早期和中期分化的標志物［12］，能夠反映OB 合成Ⅰ型膠原、形成骨基質的能力。ALP 的活性體現OB 的成骨活性［13］。ALP 在體外鈣化中起著關鍵性作用，其機制在于ALP 能夠水解有機磷酸酶，使局部PO43-濃度升高，破壞鈣化抑制劑，而啟動鈣化［14］。本實驗顯示，中、高濃度的MDP 含藥血清組與對照組相比，ALP 合成增多，活性增強，證實MDP 含藥血清能促進共育體系的OB 分化，刺激骨形成。

骨基質的降解需要多種溶酶體參與，TRAP 是酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)的同工酶之一，直接參與OC 的骨吸收過程［15］。TRAP 標志著OC 的活性，血清中TRAP 是反映OC 功能、判斷骨吸收的敏感特異性指標［16］。本實驗顯示，在成骨-破骨共育體系中，隨著培養時間的延長，中、高濃度MDP 含藥血清組和對照組相比，TRAP 活性都有所降低，提示MDP 含藥血清有抑制共育體系中OC 分泌TRAP的能力。

OC 在骨重建過程中起著啟動和先鋒作用。OC有極強的溶骨能力，其功能過度活躍時，骨吸收亢進，在骨表面和較深處形成較多的凹陷、腔隙(howship 陷窩)，甚至出現隧道，呈現骨質疏松。骨磨片上吸收陷窩是OC 骨吸收的直接結果，其陷窩數量、大小和深度直接反映了OC 的骨吸收能力。骨吸收陷窩光鏡計數法是評價體外培養OC 骨吸收功能的定量可靠方法。本實驗結果顯示，在成骨-破骨共育體系中，中、高濃度的MDP 含藥血清組骨吸收陷窩數目明顯低于對照組。說明中、高濃度的MDP 含藥血清能夠對共育體系中OC 骨吸收功能有直接抑制作用，阻止骨丟失。

細胞信息交流(即細胞通訊，cell communication)存在長距通訊和短距通訊2 種方式，長距通訊以激素或生長因子為介質，通過血液循環和局部組織液的流動，將信息從一個細胞傳到另一個細胞;短距通訊在相鄰的細胞間形成直接通道，信息物質由此進行交流。骨組織代謝是由OB 和OC 分別承擔的，處于骨形成和骨吸收不斷更新和轉換的動態平衡的骨重建活動中。OB 和OC 之間的功能活動并不是孤立存在的，二者之間的相互作用是骨代謝的直接調節因素。從單一OB 或OC 培養中獲得的實驗結果與在2 種細胞聯合培養時不同［17］。建立培養上清可以相互交流，但OB 和OC 互不接觸的共育模型更能反映骨代謝的實際情況。

本研究共育體系呈左右兩室平行結構，能在倒置顯微鏡下觀察2 種細胞的情況，可同時收集兩室的OB 和OC 進行定量指標的檢測;中間隔膜的孔徑與雙層式共育體系的孔徑一樣為0.45 μm，在此孔徑下，蛋白質可以自由通過，而OB 和OC 因直徑在30 μm 以上，不能越過濾隔膜，OB 和OC 分泌的蛋白質可以通過微孔濾膜影響對方的生物學功能。本實驗中，OC 可以促進OB 增殖和分化，OB 也可以促進OC 骨吸收作用，即OB 和OC 具有相互促進功能，其途徑是OC 分泌了某些蛋白質，彌散到隔膜的另一側影響了OB 功能。這些蛋白質中是否含有某些新的信號分子，詳細機制有待于進一步研究。

［1］ 武密山，趙素芝，任立中，等. 密骨打老兒丸對去卵巢大鼠骨質疏松的影響［J］. 中成藥，2013，35(1):5-11.

［2］ 武密山，趙素芝，任立中，等. 淫羊藿苷對去卵巢大鼠骨和下丘腦不同核團ERβ mRNA 表達的影響［J］. 中國藥理學通報，2011，27(1):29-33.

［3］ 武密山，趙素芝，任立中，等. 柚皮苷對乳鼠成骨細胞增殖及c-fos、c-jun 表達的影響［J］. 中國藥理學通報，2011，27(5):677-681.

［4］ 武密山，趙素芝，任立中，等. 補骨脂素對成骨細胞核因子-κB 受體激活配體和骨保護素表達的影響［J］. 中國老年學雜志，2012，32(1):66-69.

［5］ 武密山，李 恩，趙素芝，等. 補腎方含藥血清對大鼠成骨細胞雌激素受體mRNA 及其蛋白表達的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(10):1396-1397.

［6］ Arnett TR，Dempster DW. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro［J］. Endocrinology，1986，119(1):119-124.

［7］ Brighton CT，Strafford B，Gross SB，et al. The proliferative and synthetic response of isolated calvarial bone cells of rats to cyclic biaxial mechanical strain［J］. J Bone Joint Surg Am，1991，73(3):320-331.

［8］ 高建軍，金慰芳，王洪復. 骨片吸收陷窩光鏡計數法定量測定破骨細胞功能［J］. 上海醫科大學學報，1998 ，25(1):71-73.

［9］ 楊德鴻，金大地，陳建庭，等. 共育體系中成骨細胞和破骨細胞生物學特性觀察［J］. 中華骨科雜志，2001，21(11):676-680.

［10］ Rodan GA，Martin TJ. Role of osteoblasts in hormonal control of bone resorption:a hypothesis［J］. Calcif Tissue Int，1981，33(4):349-351.

［11］Suda T，Takahashi N. Osteoblasts are essential for osteoclast formation［J］. Calcif Tissue Int，1989，44(1):45-47.

［12］Aubin JE. Advances in the osteoblast lineage［J］. Biochem Cell Boil，1998，76(6):899-910.

［13］Effenberger KE，Johnsen SA，Monroe DG，et al. Regulation of osteoblastic phenotype and gene expression by hop-derived phytoestrogens ［J］. J Steroid Biochem Mol Biol，2005，96(5):387-399.

［14］W?odarski KH. Properties and origin of osteoblasts［J］.Clin Orthop Relat Res，1990，(252):276-293.

［15］ Yu X，Collin-Osdoby P，Osdoby P. SDF-1 increases recruitment of osteoclast precursors by upregulation of matrix metalloproteinase-9 activity［J］. Connect Tissue Res，2003，44(Suppl 1):79-84.

［16］Hayman AR ，Cox TM. Purple acid phosphatase of the human macrophage and osteoclast［J］. J Biol Chem，1994，269(2):1294-1300.

［17］ Sugimoto T，Kanatani M，Kano J，et al. Effects of high calcium concentration on the functions and interactions of osteoblastic cells and monocytes and on the formation of osteoclast-like cells［J］. Bone Miner Res，1993，8(12):1445-1452.