肝纖維化大鼠肝臟中內質網應激相關分子CHOP 和TRB3 的表達變化*

杜錫潮， 韓 冰， 謝汝佳， 鄒 河， 楊 勤

(貴陽醫學院病理生理教研室，貴州 貴陽550004)

近年研究顯示，肝細胞凋亡是導致慢性肝損傷 肝纖維化的重要因素之一，而持續的內質網應激是導致肝細胞凋亡的重要途徑。我們前期研究發現四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導肝纖維化過程中有明顯的肝細胞凋亡和內質網應激，表現為肝纖維化組大鼠肝臟內質網應激蛋白葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)表達明顯增加［1］。但肝纖維化發生發展過程中內質網應激如何引起肝細胞凋亡，其機制目前尚不清楚。有研究發現，內質網應激相關分子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)和Tribbles 同源蛋白3(Tribbles homolog 3，TRB3)是內質網應激蛋白GRP78 下游的信號分子，在內質網應激介導細胞凋亡中發揮重要作用［2-3］，但目前關于慢性肝損傷肝纖維化形成過程中內質網應激相關分子CHOP 和TRB3 的研究鮮有報道。因此本研究重點觀察CCl4致大鼠肝纖維化發生過程中內質網應激相關信號分子CHOP 和TRB3表達的變化，探討其在肝纖維化發生機制中的可能作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 CCl4(分析純，成都金山化學試劑有限公司);活化轉錄因子6 (activating transcription factor 6，ATF6)和TRB3 多克隆Ⅰ抗(北京博奧森生物技術有限公司);CHOP 多克隆Ⅰ抗和β-actinⅠ抗(Cell Signaling);二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、SABC(兔IgG)-POD 試劑盒和TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);逆轉錄試劑盒(Fermentas);2 × SYBR Green I 試劑盒(Applied Biosystems);GAPDH、CHOP和TRB3 引物由大連寶生物科技公司設計合成;TRIzol (100 mL)試劑盒(Invitrogen);組織細胞裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司);ECL 發光試劑(Millipore)。

1.2 動物分組 健康雄性Wistar 大鼠32 只，體重(180 ±20)g。大鼠適應性喂養1 周后隨機分為:正常4 周組、正常8 周組、肝纖維化4 周組和肝纖維化8 周組，每組各8 只。

1.3 動物模型建立 新鮮配制40%CCl4植物油溶液，3 mL/kg 皮下注射，每隔3 d 注射1 次造模。分別在實驗第4 周末和第8 周末股動脈放血處死相應各組大鼠，取部分肝組織切成3 mm ×1 mm ×1 mm 大小，固定于4%中性甲醛，其余肝組織于－70℃保存，用于real-time PCR 檢測和Western blotting檢測。

2 方法

2.1 肝組織病理形態學觀察 常規石蠟包埋切片，行HE 染色，光鏡下觀察肝臟病理變化，并參照纖維化分級法［4］進行膠原纖維增生程度半定量分析。

2.2 免疫組化檢測CHOP 和TRB3 蛋白表達 采用SABC 法嚴格按照試劑盒說明書操作。陰性對照以PBS 液代替Ⅰ抗。結果判定:光鏡下觀察棕黃色染成的細胞為陽性。200 倍下觀察不少于5 個視野，記數陽性細胞個數及總細胞數，計算陽性細胞所占百分比(%)。

2.3 Western blotting 蛋白印跡分析 把凍存肝組織剪切成小塊裝入1.5 mL Eppendorf 管中，稱重，按每20 mg 組織加200 μL 的比例加入裂解液，用勻漿器冰上勻漿5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清，嚴格按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒操作說明測定樣品總蛋白濃度。每孔上樣60 μg，經10%SDSPAGE 分離，電泳結束后，濕轉移法將蛋白條帶轉移至PVDF 膜上(Millipore)，5%脫脂奶粉TTBS 溶液室溫封閉1 h 后，分別加入ATF6 多克隆Ⅰ抗(1∶200)、CHOP 多克隆Ⅰ抗(1 ∶1 000)、TRB3 多克隆Ⅰ抗(1∶100)和β-actinⅠ抗(1∶1 000)置4 ℃冰箱振蕩孵育過夜。TTBS 洗膜2 次后，加入HRP 標記的Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育1 h。TTBS 洗膜4 次后，ECL 化學發光試劑于暗室中顯影，X 光膠片曝光，所得條帶用凝膠圖像分析系統掃描分析，目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白的灰度值/β-actin 蛋白的灰度值。

2.4 Real-time PCR 檢測CHOP 和TRB3 mRNA 按TRIzol (100 mL)試劑盒(Invitrogen)說明書提取大鼠肝臟的總RNA，采用紫外分光光度法進行質量控制并進行定量，逆轉錄合成cDNA，反應體系20 μL:總RNA 1 μg，5 ×PCR Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L Oligo(dT)1 μL，RNase inhibitor 1 μL，MMLV 反轉錄酶1 μL，DEPC H2O 補足體積。反應條件:25 ℃10 min，48 ℃60 min，95 ℃5 min。Real-time PCR 反應體系25 μL:反轉錄產物2 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1. 0 μL，2 × SYBR Green I 12.5 μL，DEPC H2O 補足體積。反應條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min ，95 ℃15 s，60 ℃1 min，最后2 步重復40 個循環。以每例標本組織的目的片段與帶內參照片段的循環閾值(Ct 值)的比值作為該標本基因表達的相對數值。GAPDH 上游引物 5'-GGAAGCTTGTCATCAATGG-3'，下游引物5'-CTGTGGTCATGAGTCCTTC-3'，擴增320 bp;CHOP 上游引物5'-CCTCGCTCTCCAGATTCCA-3'，下游引物5'-CTCATTCTCCTGCTCCTTCTCC-3'，擴增條帶147 bp;TRB3 上游引物5'-TCAAGTTGCGTCGATTTGTCTTC-3'，下游引物5'-CAGTCATCACACAGGCATCCTC-3'，擴增條帶84 bp。

2.5 TUNEL 檢測肝臟細胞凋亡 取相應的組織切片常規脫蠟入水，滴加0.01 mol/L TBS 1∶200 新鮮稀釋proteinase K，37 ℃消化10 min，0.01 mol/L TBS洗2 min×3 次，滴加標記緩沖液，置于濕盒中，37 ℃標記2 h，0.01 mol/L TBS 洗2 min ×3 次，滴加封閉液，37 ℃封閉30 min，甩掉封閉液，滴加用抗體稀釋液1∶100 稀釋生物素化抗地高辛抗體，37 ℃反應30 min，0.01 mol/L TBS 洗2 min ×3 次，滴加用抗體稀釋液1∶100 稀釋SABC-FITC + POD，37 ℃反應30 min，0.01 mol/L TBS 洗5 min×4 次，甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察明亮黃綠色為陽性細胞，200 倍下觀察不少于5 個視野，記數陽性細胞個數及總細胞數，計算陽性細胞所占百分比(%)。

3 統計學處理

數據用SPSS 19.0 統計軟件分析，計量資料以均數±標準差(mean ± SD)表示，均數比較用方差分析，病理學半定量結果采用秩和檢驗，以P ＜0.01 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠肝臟病理學變化

經HE 染色鏡下觀察可見，正常組大鼠肝索和肝血竇以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，無膠原纖維增生。肝纖維化4 周組大鼠主要表現為肝細胞脂肪變性，匯管區纖維結締組織輕度增生。肝纖維化8 周組大鼠肝小葉結構破壞嚴重，肝索排列紊亂，匯管區纖維結締組織大量增生，內有較多炎癥細胞浸潤，膠原纖維向肝實質延伸形成纖維間隔，包繞、分割正常肝組織，部分形成假小葉，纖維化程度較正常對照組明顯加重(P ＜0.01)，見圖1 和表1。

Figure 1. HE staining of rat hepatic tissues in each group(×200). A:4-week normal group;B:8-week normal group;C:4-week liver fibrosis group;D:8-week liver fibrosis group.圖1 各組大鼠肝組織HE 染色結果

表1 各組大鼠肝纖維化程度分級Table 1. Degree of hepatic fibrosis in rats of each group (n=8)

2 免疫組化染色結果

光鏡下觀察胞漿呈棕黃色者為陽性細胞。CHOP 和TRB3 蛋白在肝纖維化4 周和8 周組大鼠肝細胞陽性率均較正常組明顯增高(P ＜0.01)，肝纖維化8 周組大鼠肝細胞這2 種蛋白的陽性率較4 周組明顯降低(P ＜0.01)，見圖2、3 和表2。

3 Western blotting 分析結果

各組大鼠肝臟均可檢測到ATF6 蛋白，肝纖維化組大鼠肝臟p90ATF6表達量較正常組明顯減少(P＜0.01)，p50ATF6 表達量較正常組明顯增加(P ＜0.01)，見圖4;各組大鼠肝臟均可檢測到CHOP 和TRB3 蛋白，肝纖維化4 周和8 周組大鼠肝臟CHOP和TRB3 蛋白表達均較正常組明顯增加(P ＜0.01)，肝纖維化8 周組肝臟CHOP 和TRB3 蛋白表達較4周組明顯減少(P ＜0.01)，見圖5、6。

4 Real-time PCR 檢測CHOP 和TRB3 mRNA 表達

各組大鼠肝臟均可檢測到CHOP 和TRB3 mRNA 表達，肝纖維化4 周和8 周組大鼠肝臟CHOP 和TRB3 mRNA 表達均較正常組明顯增加(P ＜0.01)，肝纖維化8 周組CHOP 和TRB3 mRNA 表達量較4周組略有下降，但差異無統計學意義(P ＞0.05)，見表3。

Figure 2. The expression of CHOP protein in liver tissues detected by SABC method (DAB staining，×200). A:4-week normal group;B:8-week normal group;C:4-week liver fibrosis group;D:8-week liver fibrosis group.圖2 SABC 法檢測肝臟CHOP 蛋白表達

Figure 3. The expression of TRB3 protein in liver tissues detected by SABC method (DAB staining，×200). A:4-week normal group;B:8-week normal group;C:4-week liver fibrosis group;D:8-week liver fibrosis group.圖3 SABC 法檢測肝臟TRB3 蛋白表達

表2 各組大鼠肝臟CHOP 和TRB3 蛋白表達比較Table 2. The expression of hepatic CHOP and TRB3 proteins in each group (%. Mean±SD.n=8)

Figure 4. The expression of ATF6 protein in liver tissues detected by Western blotting. 1:4-week normal group;2:8-week normal group;3:4-week liver fibrosis group;4:8-week liver fibrosis group. Mean ±SD. n =8. ＊＊P＜0.01 vs normal groups.圖4 Western blotting 檢測肝臟ATF6 蛋白表達

Figure 5. The expression of CHOP protein in liver tissues detected by Western blotting. 1:4-week normal group;2:8-week normal group;3:4-week liver fibrosis group;4:8-week liver fibrosis group.Mean±SD. n=8. ＊＊P＜0.01 vs normal groups;##P ＜0.01 vs 4-week liver fibrosis group.圖5 Western blotting 檢測肝臟CHOP 蛋白表達

5 TUNEL 檢測肝臟細胞凋亡結果

熒光顯微鏡下觀察細胞核呈明亮黃綠色者為凋亡細胞，肝纖維化4 周和8 周組肝細胞凋亡率均較正常組明顯增高(P ＜0.01)，肝纖維化8 周組肝細胞凋亡率較4 周組明顯降低(P ＜0.01)，見圖7。

Figure 6. The expression of TRB3 protein in liver tissues detected by Western blotting. 1:4-week normal group;2:8-week normal group;3:4-week liver fibrosis group;4:8-week liver fibrosis group. Mean ± SD. n = 8.＊＊P ＜0.01 vs normal groups;##P ＜0. 01 vs 4-week liver fibrosis group.圖6 Western blotting 檢測肝臟TRB3 蛋白表達

表3 各組大鼠肝臟CHOP 和TRB3 mRNA 表達比較Table 3. The expression of hepatic CHOP and TRB3 mRNA in each group (mean±SD.n=8)

討 論

CHOP 又稱生長停滯及DNA 損傷誘導蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153，GADD153)，是一個特異性的內質網應激轉導因子，屬于CCAAT/增強子結合蛋白(CCAAT/enhancerbinding protein，C/EBP)轉錄因子家族成員［5］。近年來國內外研究結果顯示，在正常情況下CHOP 主要存在于細胞漿中且表達量很低，而細胞處于應激狀態時，通過IRE1-XBP1 和ATF6 通路可以上調CHOP表達，此外PERK-eIF2α 通路能選擇性上調ATF4，通過ATF4 可激活CHOP 及氨基酸代謝、轉運及氧化還原反應中的相關基因，導致CHOP 的表達量大大增加［6-8］。使用過表達和CHOP 基因定位突變技術的研究表明，在持續的內質網應激中CHOP 過表達可促進細胞凋亡的發生［9］。

Figure 7. Apoptotic hepatocytes detected by TUNEL staining(×200). A:4-week normal group;B:8-week normal group;C:4-week liver fibrosis group;D:8-week liver fibrosis group. Mean ±SD. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs normal groups;##P ＜0.01 vs 4-week liver fibrosis group.圖7 TUNEL 檢測肝細胞凋亡

TRB3 是果蠅tribbles 基因的哺乳動物同源蛋白，在嚙齒類動物中亦被稱為神經元細胞死亡誘導假激酶(neuronal cell death-inducible putative kinase，NIPK)［10］。近年研究發現，在內質網應激信號通路中TRB3 屬于下游因子，內質網應激時CHOP 可以與TRB3 啟動子區域的一段33 bp 堿基重復序列結合而促進TRB3 基因的表達;抑制CHOP 表達會降低其對TRB3 表達的誘導作用［11］，而不同原因引起的神經細胞內質網應激，細胞內CHOP 和TRB3 表達量明顯增加，且與相關細胞凋亡有關［12-13］。此外最近的研究也發現，多種肝臟疾病如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、藥物性肝病、急性肝衰竭、肝癌等的發生發展也和內質網應激及其介導的細胞凋亡有關［14］。

目前關于慢性肝損傷肝纖維化過程中內質網應激相關分子CHOP 和TRB3 的研究鮮有報道。本課題組前期研究發現CCl4誘導肝纖維化形成過程中，內質網應激標志性蛋白GRP78 蛋白和mRNA 較正常組明顯增加，且隨時間延長增加更加顯著，提示內質網應激參與了CCl4誘導的慢性肝損傷肝纖維化的形成［1］。本研究中我們發現，肝纖維化4 周組大鼠肝臟有明顯的脂肪肝和肝纖維化形成，而肝纖維化8 周組大鼠肝臟纖維化更加明顯，有假小葉形成;肝纖維化組大鼠肝臟p90ATF6 蛋白表達量較正常組明顯減少，肝纖維化組大鼠肝臟p50ATF6 蛋白表達量較正常組明顯增加。此外，肝纖維化大鼠肝組織中CHOP、TRB3 蛋白和mRNA 表達也較正常對照組顯著增加，且變化趨勢與肝細胞凋亡率一致。據此我們推測，CCl4進入肝細胞后，在肝細胞內代謝過程中產生大量氧自由基，導致肝細胞發生持續的內質網應激，ATF6 從GRP78 上解離，產生約90 kD 的ATF6 單體即p90ATF6［15］，p90ATF6 隨后進入高爾基體網腔［16］。在高爾基網腔特異性蛋白酶Site-1 及Site-2(S1P and S2P)作用下，切除p90ATF6 內質網跨膜結構域的附近區域，釋放胞漿側50 kD 的N 端ATF6 即p50ATF6［17］。p50ATF6 被轉運至細胞核內，一方面促進GRP78 等分子伴侶表達［18］，增強細胞對內質網應激的耐受能力;另一方面p50ATF6 與CHOP 基因的內質網應激反應元件結合，促進CHOP表達［19］。CHOP 進一步與TRB3 基因上的啟動子區域結合誘導TRB3 表達，TRB3 一方面通過負反饋機制抑制CHOP 表達［20］，使得肝纖維化8 周組大鼠肝臟CHOP 和TRB3 蛋白表達量較肝纖維化4 周組明顯減少;另一方面TRB3 可能通過抑制Akt 磷酸化間接增加Bax 轉運和線粒體膜通透性導致肝細胞凋亡［21］，參與肝纖維化的發生發展。此外本研究還發現雖然與肝纖維化4 周組相比較，肝纖維化8 周組大鼠肝臟CHOP 和TRB3 mRNA 表達量降低不明顯(P ＞0.05)，但肝纖維化8 周組大鼠肝臟CHOP 和TRB3 蛋白表達量卻比肝纖維化4 周組明顯減少(P＜0.01)，造成這種基因和蛋白表達不同步，其原因可能是隨著慢性肝損傷肝纖維化發生發展，機體內出現某些抗纖維化機制對CHOP 和TRB3 進行轉錄后調控，但具體機制還需進一步研究。

綜上所述，內質網應激可能通過CHOP 和TRB3促進肝細胞凋亡參與肝纖維化發生發展。

［1］ 溫靜靜，謝汝佳，楊 勤，等. 肝纖維化大鼠肝細胞內質網形態及GRP78 蛋白表達的研究［J］. 中國病理生理雜志，2011，27 (11):2210-2213.

［2］ Shen J，Snapp EL，Lippincott-Schwartz J，et al. Stable binding of ATF6 to BiP in the endoplasmic reticulum stress response［J］. Mol Cell Biol，2005，25 (3):921-932.

［3］ Bromati CR，Lellis-Santos C，Yamanaka TS，et al. UPR induces transient burst of apoptosis in islets of early lactating rats through reduced AKT phosphorylation via ATF4/CHOP stimulation of TRB3 expression［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300(1):R92-R100.

［4］ 楊 婷，謝汝佳，羅新華，等.丹芍化纖膠囊對肝纖維化大鼠肝臟Smads 分子表達的影響［J］. 中國病理生理雜志，2010，26(9):1807-1812.

［5］ Oyadomari S，Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress［J］. Cell Death Differ，2004，11(4):381-389.

［6］ Ron D，Habener JF. CHOP，a novel developmentally regulated nuclear protein that dimerizes with transcription factor C/EBO and LAP and functions as a dominant-negative inhibitor of gene transcription［J］. Genes Dev，1992，6(3):439-453.

［7］ Harding HP，Zhang Y，Zeng H，et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress［J］. Mol Cell，2003，11(3):619-633.

［8］ Pahl HL，Baeuerle PA. The ER-overload response:activation of NF-kappa B［J］. Trends Biochem Sci，1997，22(2):63-67.

［9］ Yoneda T，Imaizumi K，Oono K，et al. Activation of caspase-12，an endoplastic reticulum (ER) resident caspase，through tumor necrosis factor receptor-associated factor 2-dependent mechanism in response to the ER stress［J］.J Biol Chem，2001，276(17):13935-13940.

［10］Mayumi-Matsuda K，Kojima S，Suzuki H，et al. Identification of a novel kinase-like gene induced during neuronal cell death［J］. Biochem Biophys Res Commun，1999，258(2):260-264.

［11］Ohoka N，Yoshii S，Hattori T，et al. TRB3，a novel ER stress-inducible gene，is induced via ATF4-CHOP pathway and is involved in cell death［J］. EMBO J，2005，24 (6):1243-1255.

［12］閆 穎，趙詠梅，趙志偉，等. 內質網應激通路相關分子GRP78 及CHOP 在糖尿病小鼠海馬表達的變化［J］. 首都醫科大學學報，2011，32(1):90-94.

［13］Zou CG，Cao XZ，Zhao YS，et al. The molecular mechanism of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in PC-12 neuronal cells:the protective effect of insulin-like growth factor Ⅰ［J］. Endocrinology，2009，150(1):277-285.

［14］王洪巖，劉曉珺，杜雅菊，等. 內質網應激與肝臟疾病研究進展［J］. 世界華人消化雜志，2012，20(6):451-459.

［15］Nadanaka S，Okada T，Yoshida H，et al. Role of disulfide bridges formed in the luminal domain of ATF6 in sensing endoplasmic reticulum stress［J］. Mol Cell Biol，2007，27(3):1027-1043.

［16］Shen J，Chen X，Hendershot L，et al. ER stress regulation of ATF6 localization by dissociantion of BiP/GRP78 binding and unmasking of Golgi localization signals［J］.Dev Cell，2002，3(1):99-111.

［17］Ye J，Rawson RB，Komuro R，et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs［J］. Mol Cell，2000，6(6):1355-1364.

［18］ Teodoro T，Odisho T，Sidorova E，et al. Pancreatic βcells depend on basal expression of active ATF6α-p50 for cell survival even under nonstress conditions［J］. Am J Physiol Cell Physiol，2012，302(7):C992-C1003.

［19］ Gotoh T，Oyadomari S，Mori K，et al. Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages is mediated by endoplasmic reticulum stress pathway involving ATF6 and CHOP［J］. J Biol chem，2002，227(14):12343-12350.

［20］Jousse C，Deval C，Maurin AC，et al. TRB3 inhibits the transcriptional activation of stress-regulated genes by a negative feedback on the ATF4 pathway［J］. J Biol Chem，2007，282(21):15851-15861.

［21］Humphrey RK，Newcomb CJ，Yu D，et al. Mixed lineage kinase-3 stabilizes and functionally cooperates with TRIBBLES-3 to compromise mitochondrial integrity in cytokineinduced death of pancreatic beta cells［J］. J Biol Chem，2010，285(29):22426-22436.