scBsAb1/17雙特異性抗體對小鼠類風濕性關節炎模型的治療效果

齊劍英，郭 茉，葉賢龍，闞方明，張 宇，郝智超，徐黎明，任桂萍，王文飛，李德山

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節的慢性、反復發作性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病［1］。IL-1和TNF-α是目前公認的RA病中的重要炎癥介質［2］。近年來，TNF-α、IL-1β 等以單一細胞因子作為靶標的生物抑制劑在治療RA的臨床實踐中，盡管取得了一定的效果，但是在某些病人中并不能起到預期的療效［3］。造成這一結果的原因可能是由于以單一細胞因子作為靶標的生物制劑并不能夠充分的抑制多種炎癥因子在炎癥反應中所起的作用［4］。

IL-17A是近年發現的新的細胞因子，它主要表達于激活的CD4+的T淋巴細胞中［5］。IL-17位于炎癥網絡的中心，與其他炎癥細胞因子有協同作用，同時抑制IL-17、IL-1β可能會取得比抑制單一細胞因子更好的治療效果。本研究構建了雙特異性抗體scBsAb1/17，該抗體可以同時中和IL-1β和IL-17A，結果表明該抗體對Ⅱ型膠原誘導的關節炎模型(CIA)的治療效果明顯優于單價抗體。

1 材料及方法

1.1 試劑 雞Ⅱ型膠原(typeⅡ collagen，CII)，弗氏完全佐劑，PHA為美國Sigma公司產品。

1.2 實驗動物 昆明小鼠，♂，6～8周齡，體質量(20±1)g，由哈爾濱獸醫研究所提供。

1.3 蛋白表達純化 原核表達載體pET27b-scB-sAb1/17由本實驗室構建。scBsAb1/17由anti-IL-1β scFv和anti-IL-17 scFv組成，中間由一段32個氨基酸的連接肽連接。pET27b-scBsAb1/17轉化到Rossetta表達菌中，37℃培養至細菌生長對數期，加入IPTG(終濃度0.25 mmol·L－1)37℃誘導表達4 h，離心收集菌體，超聲裂解，高速離心回收包涵體，經反復洗滌后用含8 mol·L－1尿素的變性液溶解，將其逐漸稀釋于復性液中，進行復性，復性后的蛋白經離子交換層析純化，純化后的產物進行12%SDSPAGE電泳鑒定。

1.4 scBsAb1/17蛋白中和hIL-17A生物活性的細胞水平檢測 HeLa細胞在10%小牛血清(Invitrogen Corporation)，青霉素1 ×105U·L－1，鏈霉素1 ×105U·L－1，37℃、5%CO2，飽和濕度條件下于 24 孔板培養。當細胞培養鋪滿單層時，將50 ng·L－1的hIL-17蛋白與20 mg·L－1scBsAb1/17蛋白混合于室溫孵育0.5 h。加入混合蛋白至細胞培養液(只加hIL-17蛋白的細胞作為陽性對照，未經處理的細胞作為陰性對照)，繼續培養24 h，提取RNA，反轉錄成cDNA，Real-time PCR檢測IL-6、IL-8表達水平變化。

1.5 scBsAb1/17蛋白中和hIL-1β生物活性的細胞水平檢測 L929細胞稀釋成3.5×108cell·L－1的細胞懸液，接種到96孔板，每孔100 μl。取另一塊細胞培養板，每孔加入50 μl含有2%胎牛血清的RPMI 1640液體培養基，于每排的3～6孔加入梯度稀釋的scBsAb1/17抗體(第1孔不加抗原和抗體，第2孔只加抗原)，每排2至6孔加50 μl hIL-1β(10 μg·L－1)，將細胞培養板置37℃溫箱中孵育2 h。將抗原抗體混合物相對應地加到有L929細胞的培養板中，并將細胞板置5%CO2，37℃溫箱中繼續培養48 h。每孔中加入10 μl濃度為5 g·L－1的 MTT溶液，置37℃溫箱培養4 h。棄去每孔中的液體，用PBS洗板1次，于每孔中加入100 μl DMSO，置板于37℃溫箱中使MTT充分溶解。用酶標儀在570 nm讀取每孔的吸收值。

1.6 造模及給藥 小鼠關節炎模型建立:將 CII溶于0.1 mol·L－1的醋酸中，在4℃下攪拌使之充分溶解，濃度為2 g·L－1，置于4℃過夜;再將 CII與弗氏完全佐劑(CFA)等體積混合、乳化，制成 CII乳劑(即 CII濃度為 1 g·L－1)［6］。選取 6 ～8 周齡♂昆明小鼠60只，將制備后的乳劑于每只小鼠的右后足注射0.1 ml致炎。將造模成功的小鼠隨機分為7組，每組8只，分別為A:scBsAb1/17治療組(1 mg·kg－1)，B:scBsAb1/17 治療組(5 mg·kg－1)，C:scBsAb1/17 治療組(10 mg·kg－1)，D:anti-IL-1β scFv治療組(10 mg·kg－1)，E:anti-IL-17A scFv治療組(10 mg·kg－1)，F:DEX陽性藥對照組(1 mg·kg－1)，G:模型對照組(注射生理鹽水)，另選取8只昆明小鼠作為H:正常對照組。實驗組每2 d腹腔注射相應受試劑1次進行治療，對照組給予相同體積的生理鹽水，至d 49將小鼠處死取樣。

1.7 小鼠關節炎評分 小鼠造模后20 d全部發病，同時觀察關節腫脹情況，4 d評分一次 (0分:無紅腫;1分:小趾關節紅腫;2分:趾關節和足趾腫脹;3分:踝關節以下的足爪腫;4分:包括踝關節在內的全部足爪腫脹)，最高為16分。

1.8 血清抗Ⅱ型膠原抗體測定 給藥29 d后，小鼠摘眼球取血，室溫放置后離心取血清 (5 000 r·min－1，5 min)，進行 CII特異性抗體檢測。將100 μl樣品(封閉液稀釋)加入包被有抗原的96孔酶標板中，每個樣品做3個復孔，密封平板，37℃孵育1 h。清洗后加入HRP連接的抗小鼠IgG，在室溫放置1 h。底物(TMB)顯色0.5 h后，加入終止液，于450 nm測定OD值。

1.9 CII膠原特異性增殖實驗 常規分離脾細胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液將細胞濃度調成4×109cell·L－1。于 96 孔板中加入100 μl的細胞懸液，加PHA(20 mg·L－1)和CII(100 mg·L－1)刺激，未刺激組作為對照組，每實驗組設4個復孔。將細胞放置于37℃培養箱中培養72 h，MTT法測570 nm下的OD值。計算細胞增殖指數SI=(OD實驗組-OD對照)/OD對照

1.10 Real-time PCR檢測細胞因子變化 給藥29 d后，取小鼠脾臟，提取脾臟RNA并反轉為 cDNA。Real-time PCR 檢測 TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-2、IL-1 等細胞因子mRNA變化水平。TNF-α:(F:GGA AAC CCA GAG GCA TTG AC;R:TCA GGA TCT GGC CCT TGA AC);IFN-γ:(F:TGC TGA TGG GAG GAG ATG TCT;R:TGC TGT CTG GCC TGC TGT TA);IL-6:(F:GAT GCC CCA GGC AGA GAA;R:CAC CCA GGG AAT TCA AAT GC);IL-1β:(F:CCA TGG CAC ATT CTG TTC AAA;R:GCC CAT CAG AGG CAA GGA);IL-2:(F:GCA CCC ACT TCA AGC TCC A;R:AAA TTT GAA GGT GAG CAT CCT G);β-actin:(F:ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC;R:GGT ACC ACC ATG TAC CCA GG)。1.11 統計學處理 采用單因素方差分析(ANOVA)，及雙尾t檢驗進行統計學分析。

2 結果

2.1 scBsAb1/17的純化 蛋白經變性、復性及離子交換純化后，進行12%SDS-PAGE分析。如Fig 1所示，純化后的scBsAb1/17在45～66.2 ku之間呈現單一條帶，大小與理論相符，純度達到95%以上。

2.2 scBsAb1/17蛋白中和hIL-17A生物活性 見Fig 2所示，與抗原刺激的細胞相比，scBsAb1/17抗體與抗原混合處理組刺激后，HeLa細胞的IL-6和IL-8表達水平差異具有統計學意義(P＜0.01)，接近于陰性對照組的數值，具有統計學意義。該結果說明特異性抗體都能很好地阻斷hIL-17A的生物學活性。

2.3 scBsAb1/17蛋白中和hIL-1β生物活性 見Fig 3所示，與hIL-1β刺激的細胞相比，scBsAb1/17能阻斷hIL-1β刺激的L929細胞增殖(P＜0.01)，并呈劑量依賴性，說明該特異性抗體具有中和hIL-1β的中和活性。

Fig 2 Neutralizing effect of scBsAb1/17 on hIL-17was determined by Real time-PCR

Fig 3 Anti-proliferative effect of scBsAb1/17 onL929 cells stimulated with hIL-1β

2.4 scBsAb1/17對小鼠關節炎發病的影響 小鼠成模后開始給藥，每2 d給予各實驗組小鼠1次相應的受試劑，治療29 d后，對各實驗組小鼠進行關節炎臨床評分。結果表明 scBsAb1/17(10 mg·kg－1)能夠明顯地抑制CIA小鼠多發性關節炎的發生，并且治療效果要優于scBsAb1/17(1 mg·kg－1、5 mg·kg－1)組及單價抗體治療組，與CIA模型組比較差異有顯著性(P＜0.05，如Fig 4所示。

Fig 4 Effects of scBsAb1/17 on clinical scores of CIA mice(n=8，ˉ±s)

2.5 scBsAb1/17體內給藥對關節炎小鼠血清中特異性抗體產生的影響 小鼠成模后開始治療，每2 d給予各實驗組小鼠1次相應的受試劑，給藥29 d后，取血，采用ELISA方法檢測小鼠血清中CII抗體。結果顯示，未治療的CIA小鼠血清中的CII抗體水平明顯高于正常組，而經抗體治療的小鼠血清中的CII抗體水平明顯降低(Fig 5)。

Fig 5 Effects of scBsAb1/17 on serum levels ofanti-CII antibodies in CIA mice(ˉ±s)

2.6 scBsAb1/17對膠原誘導的關節炎小鼠脾細胞體外增殖實驗 小鼠成模后開始給藥，每2 d給予各實驗組小鼠1次相應的受試劑，29 d后，取小鼠脾臟，分離脾細胞進行體外培養，經CII刺激后檢測脾細胞增殖指數。結果表明，與模型對照組相比，各治療組脾細胞增殖指數都明顯降低，表現了對脾細胞增殖的抑制作用。同時，scBsAb1/17(10 mg·kg－1)治療組脾細胞增殖指數低于anti-IL-1β scFv(10 mg·kg－1)治療組，且差異有顯著性(P＜0.05)，如Fig 6所示。

Fig 6 Administration of scBsAb1/17 lowers the proliferation potential of splenocytes

2.7 scBsAb1/17體內給藥對關節炎小鼠細胞因子產生的影響 小鼠成模后開始治療，每2 d給予各實驗組小鼠1次相應的受試劑，29 d后，取各實驗組小鼠脾臟，檢測脾臟中一些細胞因子的水平變化。結果表明，相對于模型組，不同劑量scBsAb1/17都能抑制實驗組小鼠脾臟中 IL-2、IL-1、IFN-γ、IL-6和TNF-α細胞因子的表達，且差異有顯著性。相同劑量條件下，scBsAb1/17治療組的抑制效果優于anti-IL-1β scFv治療組和anti-IL-17A scFv治療組，見Fig 7。

3 討論

近年來靶向TNF-α、IL-6和IL-1的藥物已經用于類風濕性關節炎的治療，但是其對一些病人的治療效果并不理想［7－8］。有研究表明，靶向兩種細胞因子進行聯合治療取得了比靶向單一細胞因子更好的治療效果。由于IL-1是RA中重要的炎癥介質［9］，同時 IL-17 位于炎癥網絡的中心［10－11］，與 IL-1等炎癥細胞因子有協同作用，因此本實驗構建了同時靶向IL-1和IL-17的scBsAb1/17雙特異性抗體，預期達到比單價抗體更好的治療效果。將兩個抗體的可變區通過連接肽連接，并在大腸桿菌中進行該基因的功能性表達。傳統的抗體基因通常在真核細胞如CHO細胞中表達，在原核系統中的表達產物通常沒有活性，而小分子抗體則不存在這一問題，該抗體沒有糖基化位點，可直接在大腸桿菌中進行原核表達，成本低，周期短。

本研究比較了不同劑量scBsAb1/17對CIA小鼠的治療效果，同時比較了相同劑量條件下scB-sAb1/17與相對應的單價抗體(anti-IL-1β scFv和anti-IL-17A scFv)在CIA小鼠的治療效果。通過檢測小鼠脾細胞增殖、血清中CII膠原抗體、小鼠脾臟mRNA 中 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-2 和 IFN-γ 表達水平變化，得到以下結論:3種抗體和DEX治療組都能抑制脾細胞增殖及以上細胞因子的表達，對CIA模型小鼠都有治療效果;不同劑量scBsAb1/17對CIA模型鼠的治療效果呈劑量依賴性;相同劑量條件下，scBsAb1/17的治療效果要優于單價抗體(anti-IL-1β scFv和 anti-IL-17A scFv)。

目前治療RA的生物制劑中針對IL-1β的藥物只有重組人白細胞介素-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)一種，為非抗體類競爭性拮抗劑，且有許多不盡人意的地方急需改進，如用藥量大且用藥頻繁等［12］。因此，scBsAb1/17作為一種新型的、同時拮抗IL-1β和IL-17A的抗體藥物將會有很大的市場空間，有望成為治療類風濕性關節炎的新型候選藥物。

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