不同頻率糖皮質激素骨質疏松造模對大鼠肱骨的影響

陳 珺，李鳳華，袁順儀，吳玉娥，閔凡貴，趙宇紅，陸幸妍，黃 韌，李青南

(1.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院新藥功能研究中心，廣東廣州 510006;2.廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣東廣州 510633;3.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州 510006)

糖皮質激素性骨質疏松(glicocorticoid—induced osteoperesis，GIOP)是臨床應用糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)的不良反應之一［1-2］，其發病機制復雜，尚無特效防治藥物，一直是骨科領域的難題。研究中常通過建立大鼠GIOP模型觀察大鼠后肢(脛骨)和腰椎的骨形態變化，探討此癥的發病機制，開發新的治療藥物［3-5］，但就筆者查閱文獻，未見GCs對大鼠前肢(肱骨)形態結構影響的報道，大鼠是四足動物，四肢均為負重骨，前肢亦具備重要的運動功能。因此，本研究觀察短期內(30 d)不同用藥頻率應用地塞米松(dexamethasone，Dex)對SD大鼠肱骨不同部位的影響，旨在闡明GC作用下大鼠前肢的形態結構變化。

1 材料與方法

1.1 藥品地塞米松磷酸鈉注射液，廣州白云山天心制藥股份有限公司(規格1 ml:2 mg;批號110303)。

1.2 實驗動物3月齡SPF級♀SD大鼠37只，體質量(200±20)g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供〔質量合格證編號:SCXK(粵)20100020〕。分籠飼養于室溫24℃ ～28℃，相對濕度50% ～70%的清潔環境中，隔日更換墊料，自由攝食和攝水。適應性喂養1周后，隨機分為5組，具體分組及給藥情況如Tab 1所示。

Tab 1 Grouping and dosing regimen

1.3 骨標本脫鈣包埋及制片實驗結束時，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，心臟抽血處死，取右側肱骨鋸出上段 (proximal humerus，PHM)和中段(humerus shaft，HX)，經質量濃度為100 g·L-1的EDTA脫鈣處理后用Leica EG1160型包埋機(Leica Co.Germany)行石蠟包埋。用Leica RM2500型切片機(Leica Co.Germany)將PHM 和HX切出4 μm薄片，采用 HE染色法對切片染色。

1.4 骨組織形態計量學檢測本實驗所有參數采用國際通用標準骨組織形態計量學術語命名［6］，經BIOQUANT OSTEO骨組織形態圖像分析系統(BIOQUANT Image Analysis Corporation)測量獲得二維參數，再通過國際通用的公式進行計算得到三維參數后，對骨量、骨結構、骨形成和骨吸收等進行分析。

1.5 統計學處理所有參數均用±s表示，以SPSS軟件進行統計分析，單因素方差分析及LSD-t檢驗法比較組間的變量差異。

2 結果

2.1 PHM松質骨形態計量學結果如Fig 1、Tab 2所示:與B組比較，C組大鼠松質骨的骨量、骨結構均無明顯變化。與C組比較，L組松質骨的骨量、骨結構亦無明顯變化;M組和H組松質骨的骨量嚴重丟失(P＜0.01)，骨結構明顯退化，表現為骨小梁寬度明顯減少(P＜0.01)，骨小梁數目明顯降低(P＜0.05)，分離度明顯增加(M組P＜0.05;H組P＜0.01)，但組間差異無顯著性。

Fig 1 Effects of short-term application of dexamethasone in different frequency on bone histomorphometry of proximal humerus cancellousbone(4 μm，×2)

2.2 HX皮質骨形態計量學結果如Fig 2、Tab 3所示:B組與C組間無變化;與C組相比，H組骨組織總面積、皮質骨面積、皮質骨厚度、皮質骨面積百分數明顯減少(P＜0.05)，骨髓腔面積百分數明顯增大(P＜0.05)。L組和M組的這些指標差異無顯著性。

Tab 2 Comparison of histomorphometrical parameters of cancellous bone proximal humerus in different groups(±s，n=8)

Tab 2 Comparison of histomorphometrical parameters of cancellous bone proximal humerus in different groups(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal

Group %Tb.Ar/% Tb.Th/μm Tb.N/#/mm Tb.Sp/μm B C L M H 43.60 ±2.09 44.50 ±0.65 40.84 ±6.39 33.09 ±5.46＊＊33.93 ±2.62＊＊75.55 ±5.79 76.72 ±3.36 70.38 ±11.98 67.96 ±4.44*63.09 ±10.04*5.80 ±0.55 5.81 ±0.30 5.82 ±0.34 4.86 ±0.62*5.29 ±0.28*98.05 ±11.91 95.76 ±5.45 101.99 ±12.85 140.49 ±27.02*122.12 ±6.12＊＊

Fig 2 Effects of short-term application of dexamethasone in different frequency on bone histomorphometry of humerus shaft cortical bone(4 μm，×2)

2.3 PHM生長板形態計量學結果如Fig 3、Tab 4所示:B、C組間無變化;與C組相比，L組、M組和H組的生長板厚度均明顯減少(P＜0.05);M組和H組的肥大細胞直徑均明顯減小(M組P＜0.01;H組 P ＜0.05)。

3 討論

現有文獻研究GC對大鼠骨骼的影響多以后肢骨(脛骨)為對象，而未見對前肢骨的研究報道。作為四足動物，大鼠在站立和行走時前后肢均有不同程度的負重，有報道稱［7］大鼠站立狀態時前肢承重為體重的44.6%，休息狀態時前肢承受為體重的23.9%;大鼠前肢亦具有重要的運動能力(如抓取食物等)，由于前、后肢骨的生理功能、受力情況等均存在差異，因此不能單純以GC作用下后肢骨的研究結果推斷前肢骨的變化情況。本研究旨在探討短期內(30 d)相同劑量不同給藥頻率應用Dex對大鼠前肢骨(肱骨)的影響，彌補了對大鼠前肢骨研究的不足，并為GIOP模型標準化、GIOP的預防和干預提供實驗數據和理論依據。

Tab 3 Comparison of histomorphometrical parameters of humerus shaft cortical bone in different groups(±s，n=8)

Tab 3 Comparison of histomorphometrical parameters of humerus shaft cortical bone in different groups(±s，n=8)

*P ＜0.05 vs normal

Group Bone tissue area/mm2 T.Ar/mm2 Ct.Wi/mm Ma.Ar/mm2Ct.Ar/% Ma.Ar/%B C L M H 3.25 ±0.36 3.28 ±0.09 3.21 ±0.35 3.28 ±0.15 2.90 ±0.28*2.58 ±0.25 2.58 ±0.10 2.47 ±0.31 2.55 ±0.07 2.17 ±0.25*0.53 ±0.07 0.53 ±0.03 0.49 ±0.05 0.52 ±0.01 0.45 ±0.06*0.67 ±0.11 0.70 ±0.03 0.73 ±0.04 0.74 ±0.08 0.72 ±0.03 78.91 ±0.57 78.63 ±1.40 77.30 ±1.63 75.97 ±0.91 74.42 ±2.11*20.67 ±1.19 21.36 ±1.09 22.95 ±1.23 22.41 ±1.38 25.06 ±1.37*

Fig 3 Effects of short-term application of dexamethasone in different frequency on bone histomorphometryofgrowth plate(4 μm，×2)

Tab 4 Comparison of histomorphometry parameter of Growth Plate in different groups( ± s，n=8)

Tab 4 Comparison of histomorphometry parameter of Growth Plate in different groups( ± s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal

Group Growth-plate thickness/μm Mast cell diameter/μm B C L M H 96.44 ±5.51 103.71 ±3.84 92.48 ±7.03*94.15 ±6.99*95.56 ±5.25*11.59 ±0.88 11.86 ±1.33 10.95 ±1.00 9.34 ±0.93＊＊10.52 ±0.30*

本研究通過基礎對照組(B組)來建立實驗所用大鼠的骨量本底線，用以判斷其骨骼基值情況:結果表明B、C組大鼠的骨量、骨結構差異均無顯著性，說明大鼠處于骨代謝穩定期，在實驗期間不存在自然原因引起的骨骼變化(骨生長或骨丟失)。

目前普遍認為GC引起骨量丟失的程度與其累積劑量和持續應用時間等有關［8-9］。本研究在30 d中，按1.0 mg·kg-1的劑量，每周分別2次/4次/6次給予大鼠Dex，考察不同頻率用藥后肱骨的變化情況，發現每周2次應用Dex對肱骨并無明顯影響，當給藥頻率升高為每周4次時，松質骨出現骨量丟失和骨微觀結構退化，而此時皮質骨的變化不具統計學意義，每周6次應用Dex則同時導致松質骨和皮質骨的骨丟失和結構變化:Dex誘導松質骨丟失并破壞骨結構可能是Dex抑制成骨細胞成骨功能所致;而Dex不僅減少皮質骨骨外膜的骨形成，同時也增加骨內膜面的骨吸收，最終導致皮質骨骨量丟失。

生長板是骨骼縱向生長的結構基礎，哺乳動物的長骨生長板通過軟骨內成骨實現長骨的線性生長［10］，其厚度為生長板活性的指標;生長板內軟骨細胞通過增殖、分化、凋亡過程形成組織形態學上的增殖帶、肥大帶和礦化帶等結構，并受多種激素調節［11-12］，因軟骨細胞的肥大是骨骼縱向生長的主要體現，可用其直徑來衡量生長板的生長率［13-14］。本研究對生長板的形態測量結果表明藥物實驗組肱骨生長板厚度明顯降低、肥大細胞直徑明顯減小，說明Dex導致生長板活性下降，從而抑制骨生長率。

目前尚未見文獻報道大鼠肱骨中段骨形態學測量位置的選取標準，因此本研究對測量位置的選擇進行探討:如選取肱骨中段的三角肌粗隆最高點處進行定位切片測量，由于不同個體的三角肌粗隆高度存在差異，且其伸出的“尾端”(Fig 4A)不適合骨組織形態計量學軟件的標準化測量，無法得到準確的數據結果(如皮質骨厚度);參考對大鼠脛骨中段測量位置的選擇方法，以三角肌粗隆最高點為標志點，從此處開始往肱骨遠心端修片，將粗隆剛剛結束的位置所做切片定為測量切片(Fig 4C)，從形態上來看，此時的骨切片不再出現粗隆所形成的長短不一的“尾端”，不同個體的切片形態基本保持一致，符合骨組織形態計量學對切片形態位置需相對一致的測定要求。

Fig 4 Selection of measuring position of humerus shaft cortical bone

綜上所述，本研究以大鼠前肢(肱骨)為考察對象，探討GC作用下肱骨的形態結構變化，研究明確了大鼠肱骨中段的形態學測量位置;研究結果表明短期內不同頻率應用Dex對大鼠肱骨松質骨和皮質骨的影響不盡相同，肱骨松質骨表現更為敏感，提示建立短期GC誘導的骨質疏松大鼠模型時，應充分考慮不同部位、不同類型骨骼的變化情況，合理設計用藥劑量和頻率。

［1］Prani＇c-Kragi＇c A，Radi＇c M，Martinovi＇c-Kaliterna D，Radi＇c J.Glucocoriticoid induced osteoporosis［J］.Acta Clin Croat，2011，50(4):563-6.

［2］ Rehman Q，Lane N E.Effect of glucocorticoids on bone density［J］.Med Pediatr Oncol，2003，41(3):212-6.

［3］ 李青南，梁念慈，黃連芳，等.醋酸潑尼松對大鼠松質骨和密質骨影響的比較［J］.藥學學報，1999，34(7):495-7.

［3］ Li Q N，Liang N C，Huang L F，et al.Skeletal effects of prednisone acetate on trabecular and cortical bone in Sprague-dawley rats［J］.Acta Pharm Sin，1999，34(7):495-7.

［4］ 吳啟躍，馬 雯，余正紅，等.骨質疏松兩種造模方法的對照研究［J］.中國中醫骨傷科雜志，2007，15(8):17-9.

［4］ Wu Q Y，Ma W，Yu Z H，et al.The control study of comparing with two modeling methods in osteoporosis［J］.Chin J Trad Med Traum Orthop，2007，15(8):17-9.

［5］ Sun P，Cai D H，Li Q N，et al.Effects of alendronate and strontium ranelate on cancellous and cortical bone mass in glucocorticoidtreated adult rats［J］.Calcif Tissue Int，2010，86(6):495-501.

［6］ Parfitt A M.Bone histomorphometry:Standardization of nomenclature，symbols and units(summary of proposed system)［J］.Bone，1988，9(1):67-9.

［7］ 孫聯文，楊 肖，謝 添，樊瑜波.尾吊模型中大鼠的前肢承重分布.第九屆全國生物力學學術會議論文摘要匯編［C］.2009:29.

［7］ Sun L W，Yang X，Xie T，Fan Y B.Forelimbs load-bearing distribution in tail suspension model rats.Abstracts compilation of the Ninth National Biomechanics Conference［C］.2009:29.

［8］ Vestergaard P，Rejnmark L，Mosekilde L.Fracture risk associated with systemic and topical corticosteroids［J］.J Intern Med，2005，257(4):374-84.

［9］ McLaughlin F，Mackintosh J，Hayes B P，et al.Glucocorticoidinduced osteopenia in the mouse as assessed by histomorphometry，microcomputed tomography，and biochemical markers［J］.Bone，2002，30(6):924-30.

［10］ Van der Eerden B C，Karperien M，Wit J M.Systemic and local regulation of the growth place［J］.Endocr Rev，2003，24(6):782-801.

［11］ Chagin A S，S?vendahl L.Genes of importance in the hormonal regulation of growth plate cartilage［J］.Horm Res，2009，71，(Suppl 2):41-7.

［12］ Nilsson O，Marino R，De Luca F，et al.Endocrine regulation of the growth plate［J］.Horm Res，2005，64(4):157-65.

［13］ Nuttall J D，Brumfield L K，Fazzalari N L，et al.Histomorphometric analysis of the tibial growth plate in a feline model of mucopolysaccharidosis type VI［J］.Calcif Tissue Int，1999，65(1):47-52.

［14］ Loveridge N，Farquharson C，Palmer R，et al.Growth homone and longitudinal bone growth in vivo:short-term effects of a growth homone antiserum［J］.J Endocrinol，1995，146(1):55-62.