血中游離DNA與腫瘤

王慶琳，張 榮，肖 莉，4，王偉大，孫愛娟，李 凱，顧振綸

(1.蘇州大學藥學院分子診斷與生物制藥實驗室，江蘇蘇州 215000;2.蘇州大學附屬第二醫院婦產科，江蘇蘇州 215004;3.蘇州中藥研究所，江蘇 蘇州 215000;4.蘇州大學附屬第二醫院分子醫學中心，江蘇 蘇 州 215004)

血中游離DNA簡稱循環核酸(circulating nucleic acid)，是指循環血中游離于細胞外的部分降解了的機體內源性DNA。這里，循環核酸非名義上的循環血中的核酸類物質，所有細胞內的核酸，血中游離的內源性脫氧核糖核酸和外源性DNA與RNA，如真菌血癥、細菌血癥和病毒血癥等病理情況下的血中外源核酸，雖然其在臨床醫學中具有重要意義但均不屬于本文血中游離DNA討論的范疇。

循環核酸最早由 Mandel和Metais［1］于1947年發現，但由于缺乏高靈敏性和高特異性的實驗方法，導致有關血中游離DNA與疾病相關性的研究在較長時期內進展緩慢。直到有效分離游離DNA技術的出現，特殊熒光染料與PCR技術相結合的檢測技術的應用，使這一領域的研究在最近二十多年得到了較迅速發展(Tab 1)。自發現血中游離DNA可含腫瘤細胞DNA相同基因突變后，應用分子生物學手段對循環游離核酸的研究興趣日益增加，血中游離DNA在疾病的早期診斷、預后、監測等方面具有重要潛在價值。

1 血中游離DNA的來源及性質

血中游離DNA產生的生物學機制較為復雜，除正常細胞的衰老死亡之外，一般認為腫瘤游離DNA主要來源于凋亡與壞死的腫瘤細胞。目前多數研究證明腫瘤組織細胞DNA與游離DNA存在一致的基因改變。腫瘤患者血中游離DNA主要來源于腫瘤細胞壞死凋亡后擴散以及增生活躍腫瘤細胞的釋放。對肝癌患者和正常人游離DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳時，肝癌患者標本的DNA可表現出較明顯的DNA凋亡梯帶，可見凋亡細胞可能是游離DNA的重要來源［2］。有報道估計，當直結腸癌患者腫瘤大小為100g時，每天可有高達3.3%即約3 300ng的腫瘤DNA進入外周血中［3］。

血中游離DNA大都以DNA與蛋白質相結合的復合物形式存在，僅少部分為游離DNA片斷。健康人血中僅有少量來自壞死或凋亡的衰老細胞DNA，體內自身的平衡機制使健康人的血中游離DNA維持在一個較低水平，正常人外周血中游離DNA含量大部分在100 μg·L－1之下，平均約30 μg·L－1［4］。與正常人相比，腫瘤患者的游離 DNA 濃度增高，這些增加的游離DNA來自腫瘤細胞以及與腫瘤細胞相鄰近的非腫瘤細胞，腫瘤患者外周血中游離DNA濃度可高達1 000 μg·L－1，其平均值為 180 μg·L－1［5］。游離 DNA大部分都是雙鏈DNA分子，血中游離DNA片段遠小于基因組 DNA，片段長度集中在 0.18 ～ 21 kb 之間［6－7］。Chang等［8］研究表明不同實驗組游離DNA水平有統計學差異:腫瘤組122例，非腫瘤組164例，健康對照組44例，測得各組游離DNA水平中位數分別是:腫瘤組59 μg·L－1，非腫瘤組16 μg·L－1，健康對照組7 μg·L－1，表明該論文中的中國腫瘤患者血中游離DNA水平較正常對照有數倍的增加。腫瘤病人血中游離DNA的水平與腫瘤的大小及位置的關系仍有待進一步研究，比較肯定的是在腫瘤發生轉移時，血中游離DNA 水平會明顯增加［9］。

表1 血中游離DNA臨床研究中的里程碑事件［10］

2 血中游離DNA的提取

游離DNA的濃度與多種因素相關，如提取時抗凝劑的使用與否以及所用種類，EDTA抗凝優于肝素或檸檬酸，對涉及到PCR的實驗應避免使用肝素。此外，血樣存儲的溫度、血樣儲存的時間、離心力的大小等因素也能造成血中游離DNA濃度的變化。有文獻表明:人血清中的DNA含量可高于血漿3～24倍，血清高于血漿的游離DNA來自于白細胞在體外凝血、纖溶的過程，與病人血中實際的游離DNA數量可能并不相符［10］。

采用不同的提取方法，對游離DNA的濃度有一定的影響。有研究采用傳統的酚－氯仿法，硅膠膜吸附柱的商品化提取試劑盒以及磁珠法提取游離DNA，并對3種方法進行比較。研究結果表明，酚－氯仿法的DNA提取效率低，重復性差，不適于微量游離DNA的提取。采用微柱吸附原理的試劑盒簡便快速，能有效地除去樣本中的各種PCR抑制物，獲得較純的DNA，但是其對小片段DNA提取效率低于磁珠法。磁珠法采用磁珠吸附、磁場分離的原理，操作簡便、快速，獲得的DNA純度高，相對丟失率最小，尤其適合于小片段 DNA的提?。?1］。

3 血中游離DNA的定性檢測

腫瘤發生與原癌基因被激活或抑癌基因受抑制等多種基因突變相關。與腫瘤相關的基因突變包括遺傳性和體細胞突變，主要表現為點突變、缺失、插入、DNA重排以及非正常基因融合等。隨著分子生物學的發展，以PCR為基礎的一系列技術成為檢測基因突變簡單和有效的手段。在PCR反應的體系中，引物和模板相結合，經過多次循環后，產物將以指數級擴增。按研究對象和目的的不同可采用不同的方法，主要方法簡述如下:

(1)PCR-SSCP法:不同序列組成的單鏈DNA或RNA的空間構象不同，其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時可表現出不同的遷移率，通過與對照核酸進行比較，從而間接反映模板DNA序列間的差異。這類方法主要用于未知突變的篩查。(2)PCR-RFLP法:根據已知突變位點的特征，選擇限制性內切酶。通過酶切后的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后的片段長度，可以分析出原DNA突變情況。有實驗室用此方法對B3-ARTrp64Arg基因，CYP3A53、CYP3A418B基因的遺傳多態性進行分析［12－13］。(3)測序分析:根據目的基因的序列，設計特異性引物，PCR反應的產物經瓊脂糖凝膠電泳分離出目的產物，將產物純化，進行測序分析。測序分析目前仍為突變分析的金標準，既可用于未知突變的篩查，也用于已知突變的確認。(4)特異性引物延伸法:其中高保真聚合酶結合硫化修飾或者熒光標記的分子開關技術通過標記引物3'末端，利用高保真酶的保真性，配對引物得到帶標記的產物，而不配對的引物將得不到產物，可以通過產物的有無，判斷有無對應的已知突變［14］。

4 血中游離DNA與腫瘤臨床

由于血中游離DNA相對無創，簡便的樣本取材方式以及與腫瘤的相關性使其具有廣泛的臨床應用前景。血中游離DNA的定性分析，可以對腫瘤進行診斷，血中游離DNA水平的定量分析可以對腫瘤進行分級，確定其腫瘤的發展階段，制定相應的治療方案，通過對血中游離DNA水平的檢測，可判斷患者對放療的敏感性，以及對腫瘤進行預后包括轉移風險的分析［10］。目前臨床上除了與腫瘤緊密結合外，逐漸在產前診斷、感染性疾病、免疫性疾病、遺傳性疾病中體現血中游離DNA的應用價值。

4.1 癌基因或抑癌基因的突變 外周血中最先檢測到的與腫瘤相關的突變基因是Tp53基因和K-ras基因。腫瘤抑制基因p53是人類腫瘤中最常突變的基因，且具有遺傳性突變家系的存在。已在結直腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤患者游離DNA中檢測到p53的點突變［15－17］。Tp53基因突變是肺癌中較為研究深入的腫瘤抑制基因。小細胞肺癌中約90%有Tp53基因的改變，非小細胞肺癌中約50%的Tp53基因突變，最常見的突變形式是C-T的顛換。

K-ras基因是人類腫瘤中常見的原癌基因之一，在人類30%的腫瘤中存在點突變［18］。胰腺癌K-ras基因點突變率平均為80.5%(560/696)［19］，K-ras基因突變與胰腺癌的腫瘤大小、分期及復發率明顯相關，并可作為胰腺癌患者的生存分析的獨立預后指標。直結腸癌K-ras基因點突變率達40% ～50%以上，且點突變幾乎皆位于12、13、61號密碼子，其中大多數點突變位于12號密碼子［20］。通過血中游離DNA檢測到上述相對高發的基因突變，不但可提供早期預警，還在一定程度上為腫瘤的定位診斷提供參考。

4.2 基因甲基化異常 表觀遺傳學變化是各種惡性病的一種重要的分子改變。而常見的腫瘤相關表觀遺傳學改變，特別是基因啟動子高甲基化，已在腫瘤患者血漿/血清檢測中得到證實。Esteller等［21］分析了22例非小細胞肺癌患者腫瘤組織和血清中多個基因啟動子高甲基化的發生情況，發現68%(15/22)的腫瘤組織中存在至少一種基因的啟動子甲基化，而在正常肺組織中檢測結果為陰性。從有關宮頸癌患者血漿DNA的基因啟動子甲基化狀態的研究中，進一步發現隨宮頸癌的臨床分期增加和細胞分化不良，血漿中DNA的啟動子甲基化檢出率逐漸增加。

4.3 微衛星改變 微衛星是基因組中由小于10個堿基組成的DNA串聯重復序列，微衛星的改變是腫瘤發生、發展的重要事件，微衛星突變的發生與DNA錯配修復系統有關，突變形式包括微衛星不穩定性和雜合性缺失。有研究［22］對21例小細胞肺癌病人的血漿游離DNA和相對應的腫瘤組織DNA中微衛星改變進行了檢測并與正常細胞的相同重復序列進行比較。腫瘤組織中檢測出微衛星改變為16/21(76%)，血漿游離DNA中檢出微衛星改變為15/21(71%)，腫瘤組織和血漿DNA的微衛星改變檢出率幾乎一致。在非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌等許多腫瘤患者的循環DNA中已檢測到了微衛星的改變［23－26］。

4.4 血中游離的線粒體DNA 線粒體DNA為以母系遺傳為主的環狀核酸分子，在單個細胞中具有數百至數千拷貝，其作為游離于基因組DNA以外的核酸物質，具有較高的突變率。隨著對血中游離DNA認識的深入以及血液檢測技術的發展，線粒體DNA突變荷載水平與相關腫瘤的臨床價值也愈來愈多地被證實。Strelkova IIu等［27］通過對8名肺癌患者以及健康志愿者研究表明，線粒體突變水平與年齡正性相關，而未經化療的肺癌患者線粒體突變率明顯高于正常人對照組，經化療后，突變線粒體水平增加一倍，可能是由于壞死的腫瘤細胞釋放或正常細胞受損所致。Mehra等［28］對75名膀胱癌患者的線粒體進行多變量分析，研究數據提示膀胱癌患者體內的線粒體DNA及RNA荷載水平可作為兩年存活率的獨立指標之一。血中游離DNA亦或線粒體DNA的荷載水平與腫瘤的相關性已較為確定，對其進行定量分析并檢測其是否突變，有助于提高腫瘤的早期診斷水平及預后監控，并可能為研究腫瘤的發病機制提供新思路。

4.5 血中游離DNA與腫瘤轉移 近年來，對血中游離的DNA與腫瘤轉移的研究結果顯示，腫瘤遠處轉移與血漿DNA水平具有一定的相關性，在血中游離DNA水平較高的患者，發現轉移腫瘤病灶的幾率同樣較高。然而，這一相關性并不能表明其相互的因果關系。為了證實血中游離DNA可以進入細胞內，導致腫瘤的形成，Dolores等［29］使用直結腸癌患者的血漿培養腫瘤易感細胞，得到與血中游離DNA一致的突變型基因的細胞，將含有該基因突變型的細胞植入小鼠體內，一段時間后小鼠體內形成了腫瘤。這一實驗不但有力證實了血中游離DNA與腫瘤的轉移有密切的聯系，還在一定程度上提示，除癌細胞的直接遠處轉移之外，腫瘤突變基因的遠處轉移，也可能通過細胞轉化而導致繼發病的形成。

5 結論與展望

血中游離DNA的檢測，在個體化醫學中將具有越來越重要的應用價值。隨著基因突變致腫瘤的確定以及其在多種其他疾病如自身免疫性疾病和退行性疾病發生發展中作用的認識，用于基因突變檢測的標本，已逐步從術后腫瘤組織發展到了痰液、尿液、糞便、胰液和膽汁等多種體液。新近發展起來的外周血游離核酸檢測，通過檢測血中游離DNA的含量和其完整性，可評價罹患腫瘤的風險，并可能對部分腫瘤作出超早診斷。對確診的腫瘤患者，血中游離核酸的定量與定性分析，還可用于個體化的治療方案的確定，以指導臨床合理用藥，并在一定程度上對預后進行評估。

血中游離DNA的檢測，還可對特定熱點突變包括甲基化進行針對性分析。這種檢測對腫瘤復發的監控，具有較現有腫瘤標志物如腫瘤胚胎抗原(CEA)更高的可靠性［30］。值得指出的是，血中游離核酸檢測方法各自的靈敏性相差較大，并且游離DNA檢測的特異性尚有待提高。由于血中游離DNA水平的個體差異較大，對其進行定量分析時的動態觀察價值尤為明顯。目前研究顯示血中游離DNA的突變與腫瘤組織具有一致性，利用現有的分子生物學技術，提高血中游離DNA檢測的靈敏性及特異性，通過對血中游離DNA更為準確地定性和定量，必將擴大其臨床應用尤其是在腫瘤防治中的應用。

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