水楊酸甲酯糖苷抗大鼠急性胸膜炎的作用研究

黃 超，張 丹，辛文妤，李永潔，張天泰，杜冠華

(藥物靶點研究與藥物篩選北京市重點實驗室，北京協和醫學院＆中國醫學科學院藥物研究所，北京 100050)

民族中藥滇白珠(學名:Gaultheria leucocarpa var.crenulata)是杜鵑花科白珠樹屬白果白珠的變種，分布于中國大陸的長江流域以南等地。滇白珠主要用于清熱解毒、活血化瘀、祛風除濕、順氣平喘，民間多用于治療類風濕性關節炎等疾病。水楊酸甲酯糖苷(DL0309)是我們從滇白珠中提取的活性化合物，它具有水楊酸的結構，前期的研究也發現該化合物具有抗炎鎮痛作用，其抗炎作用與抑制炎癥介質的產生和分泌有關［1－2］。

本研究通過建立角叉菜膠誘導的大鼠胸膜炎模型，考察DL0309是否具有抗大鼠胸膜炎的作用，探討DL0309抗炎作用與抑制炎癥介質及抗氧化作用之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 DL0309(由中國醫學科學院藥物研究所合成，純度:99%);地塞米松(購自北京市友誼醫院);角叉菜膠(購自Sigma，2329535，FC.NO.2829535，lot＆filling code:1408463 50309274［9064－57－7］);BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20111018);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20111110);大鼠TNF-α酶聯免疫試劑盒(購自北京四正柏生物科技有限公司，Lot:20120616)、大鼠IL-1β酶聯免疫試劑盒(購自欣博盛生物科技有限公司，Lot:R120615-07a)、大鼠PGE2酶聯免疫試劑盒(Catalog No.F16550);水合氯醛(購自國藥集團化學試劑有限公司，批號:20100111);

1.1.2動物 Sprague-Dawley(SD)♂大鼠，清潔級，體質量130～160 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號:SCXK(京)2012－0001。

1.1.3儀器 Spectra Max M5(美國 Molecular Devices公司產);離心機(GS-15R離心機，美國 Beckman公司產)。

1.2方法

1.2.1動物分組、造模及給藥 取健康♂ SD大鼠48只，按體重隨機分為6組，空白對照組、模型對照組、地塞米松組(5 mg·kg－1，ip)、DL0309(150、300、600 mg·kg－1，ig)。造模前 5 d 給藥(空白組、模型組給等劑量溶劑，地塞米松組給予等劑量的生理鹽水)，造模當天，腹腔注射地塞米松及其他各組給藥1 h后，將大鼠用乙醚麻醉，于右胸腔(以動物為視角)第6肋間向內注射10 g·L－1角叉菜膠0.2 ml，空白對照組注射等劑量生理鹽水［3－6］。

1.2.2動物處理 造模5 h后，將動物用10%水合氯醛以4 ml·kg－1腹腔注射麻醉，分離腹主動脈，取血(5 000 r·min－1，4 ℃，離心 5 min)，取血漿，－20℃保存。打開胸腔，向胸腔內注入2 ml胸腔洗液(含1%EDTA的生理鹽水)，輕柔振蕩，收集液體并測量體積;取20 μl胸腔滲出液加入380 μl白細胞稀釋液中，混勻后，顯微鏡下計數。將胸腔滲出液離心，1 200 ×g，4 ℃，離心15 min，取上清，－20℃保存待用。

1.2.3抗炎作用相關指標的測定 收集胸腔滲出液，并測量體積，加細胞稀釋液后，對其中的白細胞進行計數［5－7］;該滲出液離心取上清，進行以下指標的測定:BCA法測定蛋白含量，Griess法測定NO含量;ELISA方法測定IL-1β、TNF-α 和 PGE2［8］;取出的血漿，按試劑盒說明，測定 MDA和 SOD含量［9－10］。

1.2.4統計學處理各組數據以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗進行統計。

2 結果

2.1DL0309對大鼠急性胸膜炎胸腔滲出液體積、白細胞計數的影響角叉菜膠造模5 h后，模型組大鼠胸腔滲出液的體積和白細胞總數均明顯高于正常對照組(P＜0.01);陽性對照組(地塞米松)可明顯降低胸腔滲出液的體積及白細胞數，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);而DL0309低、中、高治療組也不同程度地降低了胸腔滲出液的體積和白細胞數目，其中中(P＜0.05)、高(P＜0.01)劑量組與模型組比較差異有顯著性。見Fig 1。

2.2DL0309對大鼠急性胸膜炎胸腔滲出液中蛋白質含量及NO含量的影響角叉菜膠致大鼠胸膜炎模型中，胸腔滲出液中蛋白質和NO含量明顯增加，與正常對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.01);預防給予不同濃度的DL0309均能降低胸腔滲出液中的蛋白含量，其中中劑量組和高劑量組與模型組比較差異有顯著性(P＜0.05和P＜0.01);陽性對照藥(地塞米松)能明顯降低胸腔滲出液中的蛋白含量，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);對于NO含量，陽性藥及不同劑量DL0309均能不同程度降低其在胸腔滲出液中的含量，但與模型組比較差異均無統計學意義。結果見Fig 2。

2.3DL0309對大鼠急性胸膜炎胸腔滲出液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和PGE2的影響與正常組大鼠比較，角叉菜膠誘發的胸膜炎大鼠胸腔滲出液中IL-1β、TNF-α和 PGE2的含量均明顯增加;給予不同劑量DL0309的治療組大鼠胸腔滲出液中IL-1β、TNF-α和PGE2的含量出現不同程度的降低，其中高劑量組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。陽性對照藥(地塞米松)能明顯降低胸腔滲出液中三者的含量，與模型組比較差異有統計學意義。結果見Fig 3。

Fig 1 Effects of DL0309 on exudate volume and total leukocyte number in carrageenan-induced pleurisy model in rats

2.4DL0309對大鼠急性胸膜炎血漿中MDA和SOD的影響模型組大鼠血漿中MDA濃度明顯增加，SOD活力值明顯降低，給予不同劑量的DL0309后均能不同程度地降低血漿中MDA的濃度，其中中、高劑量組與模型組比較差異有顯著性(P＜0.05);同時，DL0309低、中、高劑量均能明顯升高血漿中SOD的活力，與模型組比較差異有顯著性(P＜0.05)。陽性對照藥均能明顯降低血漿中MDA的含量和升高SOD的活力(P＜0.01)。結果見Fig 4。

3 討論

炎癥是機體對外來侵入的一種防御性免疫性反應，嚴重的這種免疫反應會造成機體的損傷。炎癥反應是臨床常見的病理反應過程，幾乎可以發生于機體各部位的組織和器官。角叉菜膠誘導的大鼠急性胸膜炎是一種理想的急性炎癥模型，可以定量分析胸腔滲出液體積及其成分、白細胞遷移以及其他炎癥相關分子的產生，從而評價急性炎癥在動物體內的反應。

Fig 2 Effects of DL0309 on exudate protein concentration and NO level in carrageenan-induced pleurisy model in rats

生理情況下，胸膜腔只有少量的液體，在發生炎癥等病理狀況下，胸腔膜的滲透性增加，胸腔中大量液體滲出。本實驗研究結果表明DL0309能明顯抑制液體的外滲以及白細胞的遷移，減少急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液的量，同時滲出液中蛋白質的含量也明顯降低，滲出液中白細胞數減少，表明DL0309可以有效地抑制角叉菜膠誘發的胸膜炎大鼠中炎性液的外滲以及白細胞的遷移。

PGE2和NO是炎癥反應過程中由巨噬細胞釋放的重要的炎性介質。PGE2是花生四烯酸代謝途徑中COX-2介導產生的重要炎性介質，本研究結果顯示DL0309可以降低急性胸膜炎大鼠胸腔液中PGE2的含量，而本課題組的前期研究表明DL0309可以直接抑制COX-2的活性，所以胸腔液中PGE2水平的降低可能與DL0309抑制COX-2的活性有關。

Fig 3 Effects of DL0309 on exudate IL-1β，TNF-α and PGE2 concentration in carrageenan-induced pleurisy model in rats

生理情況下，NO發揮著調控血管擴張和宿主防御的重要作用，炎癥刺激時可以導致NO的大量產生，大量由誘導性NO合酶產生的NO是重要的炎癥介質，通過產生氧自由基而引起細胞損傷［11］。

Fig 4 Effects of DL0309 on plasma MDA concentration and SOD concentration in carrageenan-induced pleurisy model in rats

IL-1β是一個重要的促炎性細胞因子，有調節免疫和炎癥反應的多個方面作用。急性炎癥可上調炎癥部位IL-1β水平，IL-1β的水平的升高，可引起細胞或組織的損傷［1］。TNF-α(tumor necrosis factorα)是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，T淋巴樣細胞系、中性粒細胞等亦可產生。大量產生的TNF-α不僅介導炎癥反應，同時還可以進一步誘導巨噬細胞產生IL-1β和IL-6，從而加重局部的炎癥反應［12］。DL0309可明顯抑制大鼠胸膜炎模型胸腔滲出液中IL-1β的生成和分泌，并抑制TNF-α的產生。

目前認為炎癥的發生發展與自由基造成的損傷有密切的關系。因此，抑制自由基的生成可能成為抗炎免疫藥物發揮作用的重要機制，抗氧化劑的開發也成為開發此類藥物的方向。機體通過酶系統或非酶系統產生氧自由基，它能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發脂質過氧化反應，形成過氧化脂質(LPO)，進一步分解為丙二醛(MDA)、酮基、羰基及新的自由基，因此MDA的量通常可以反映機體被脂質過氧化的程度及機體細胞受自由基攻擊的程度。超氧化物歧化酶(SOD)是一種源于生命體的活性物質，能消除體內在新陳代謝中產生的有害物質，尤其是對氧自由基，SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。在本實驗中可以發現，DL0309對大鼠胸膜炎模型血漿中MDA的含量有明顯的抑制，除此之外，可以明顯增強SOD的活力，兩者綜合，進一步提示了DL0309發揮抗炎作用可能與抗氧化關系密切。

綜上，DL0309可以明顯抑制角叉菜膠誘導的急性胸膜炎大鼠胸腔中滲出液的量，同時抑制了白細胞向炎性部位胸腔液的遷移，胸腔液中蛋白的含量也明顯降低。DL0309還不同程度地抑制了胸腔液中炎性分子PGE2、NO和自由基、前炎性因子TNF-α和IL-1β等的產生。說明DL0309具有明顯的抗角叉菜膠誘導的大鼠急性胸膜炎作用。

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