瓜子金皂苷己對(duì)連二亞硫酸鈉致氧糖剝奪/復(fù)供誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用

石瑞麗，胡金鳳，孔令雷，牛 非，吳苗苗，何 鑫，3，李培鋒，陳乃宏

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼 和浩特 010018;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050;3.包頭醫(yī)學(xué)院生理教研室，內(nèi)蒙古包頭 014040)

瓜子金皂苷己(polygalasaponin F，PGSF)是從遠(yuǎn)志屬中草藥瓜子金中分離得到的齊墩果烷型三萜皂苷單體，體內(nèi)試驗(yàn)表明其具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜、抗焦慮和催眠的作用。最新報(bào)道PGSF對(duì)MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)所致PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［1］，可通過(guò)促進(jìn)大鼠海馬齒狀回突觸傳遞發(fā)揮促智功能［2］。提示PGSF可能具備廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究旨在探討 PGSF對(duì)氧糖剝奪/復(fù)供(oxygen-glucose deprivation and reperfusion，OGD/R)模擬缺血/再灌注損傷所致的PC12細(xì)胞凋亡有無(wú)保護(hù)作用，作用機(jī)制如何。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物與試劑 PGSF由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成室提供，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解備用;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);Bcl-2和Bax一抗(美國(guó)Santa Cruz);ECL發(fā)光試劑(北京普利萊公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清(美國(guó)Gibco公司);Hochest33342、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、β-actin 抗體(美國(guó)Sigma公司);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京Vigorous公司);連二亞硫酸鈉(sodium dithionite，Na2S2O4)及其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞株 PC12細(xì)胞(pheochromocytoma cells)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心提供。

1.3 儀器 Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司);BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);LAS-3000化學(xué)發(fā)光及影像分析儀(日本富士);RCM8000型熒光顯微鏡(日本Nikon)。

2 方法

2.1 模型制備及分組 PC12細(xì)胞用含5%胎牛血清和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以5×104個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h，用于分組處理。造模細(xì)胞用含10 mmol·L－1Na2S2O4的無(wú)糖Earle’s液孵育4 h作為氧糖剝奪處理，然后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h作為復(fù)氧復(fù)糖處理。實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組、OGD/R模型組、OGD/R+PGSF(10.00、1.00、0.10 μmol·L－1)組。給藥組在氧糖剝奪過(guò)程的Earle’s液和復(fù)氧復(fù)糖過(guò)程的完全培養(yǎng)基中都加入相應(yīng)藥物。

2.2 Hoechst 33342/PI熒光染色觀察細(xì)胞凋亡造模及給藥后，PC12細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液固定，加入終濃度各為 10 μmol·L－1的 Hoechst 33342和PI，避光染色20 min，PBS漂洗兩次，在熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng)OGD/R處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用胰酶消化并吹下貼壁細(xì)胞，合并細(xì)胞懸液，2 000 r·min－1離心 5 min，棄上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Annexin V和PI染色，隨即上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。Annexin V-FITC染色陽(yáng)性為綠色熒光，PI染色陽(yáng)性為紅色熒光。

2.4 JC-1熒光染色測(cè)定線粒體膜電位 (mitochondrial membrane potential，MMP)造模結(jié)束后，用PBS漂洗細(xì)胞1次，然后加入PBS溶解的10 μmol·L－1JC-1，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱負(fù)載20 min，PBS 漂洗后于熒光顯微鏡下拍照。

2.5 Western blot檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá) 造模及藥物處理結(jié)束后，棄上清，收集細(xì)胞，4℃，2 500 r·min－1離心5 min，取沉淀，經(jīng)PBS漂洗后，加入細(xì)胞裂解緩沖液100 μl，冰浴30 min，收集細(xì)胞裂解液，12 000 r·min－1離心30 min，取上清用 BSA 法進(jìn)行蛋白定量。每組取蛋白樣品10 μg上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3%BSA室溫封閉2 h，加一抗于4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光儀成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Fig 1 PGSF inhibits OGD/R-induced injury in PC12 cells

3 結(jié)果

3.1 Hoechst 33342/PI染色結(jié)果 正常對(duì)照組細(xì)胞核被Hoechst 33342著染后呈均勻藍(lán)色熒光;凋亡細(xì)胞核因染色質(zhì)凝聚呈現(xiàn)不均勻強(qiáng)藍(lán)色熒光，或因核碎裂出現(xiàn)凋亡小體;晚期凋亡或壞死細(xì)胞因?yàn)榧?xì)胞膜被破壞，細(xì)胞核被PI著染而呈強(qiáng)紅色熒光。OGD/R組紅色熒光細(xì)胞較正常組明顯增多，說(shuō)明大量細(xì)胞死亡;PGSF各劑量組紅色熒光細(xì)胞都明顯少于模型組，染色質(zhì)凝聚及細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象減少，表明PGSF可明顯減少OGD/R處理細(xì)胞的晚期凋亡或壞死數(shù)量。見(jiàn)Fig 1及Tab 1。

3.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，PGSF主要影響細(xì)胞晚期凋亡 /壞死百分率。OGD/R處理使細(xì)胞晚期凋亡/壞死率由正常對(duì)照組的 4.04% 增至 28.24%，PGSF 10.00、1.00、0.10 μmol·L－1可分別使細(xì)胞晚期凋亡/壞死率降低至10.07%、10.42%、16.74%。再次驗(yàn)證了PGSF對(duì)OGD/R處理PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，且其作用具有濃度依賴(lài)性。

3.3 線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示:正常組細(xì)胞被激發(fā)后多數(shù)呈紅色熒光，線粒體膜電位正常，呈綠色熒光細(xì)胞僅占(4.6±0.1)%;OGD/R處理可使(82.8±3.1)% 的細(xì)胞呈綠色熒光，說(shuō)明多數(shù)細(xì)胞線粒體膜電位降低，與正常組差異具有顯著性(P＜0.01)。PGSF 10.00、1.00、0.10 μmol·L－1組呈綠色熒光細(xì)胞分別占(17.7±1.4)%、(24.4±3.4)%和(59.3±5.6)%，與OGD/R組比較明顯減少(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，說(shuō)明 PGSF可濃度依賴(lài)性地抑制OGD/R引起的線粒體膜電位的降低。見(jiàn)Fig 2。

3.4 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果 由Fig 3可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，OGD/R可使PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2/Bax比值明顯降低;PGSF 10.00、1.00、0.10 μmol·L－1分別使 Bcl-2/Bax 比值回升至模型組的2.6倍、2.4倍和2.3倍。

Tab 1 Effect of PGSF on PI positive cells induced by OGD/R

4 討論

腦缺血后盡快恢復(fù)血流是防治缺血損傷的最有效措施，然而再灌注損傷會(huì)使腦功能出現(xiàn)更加嚴(yán)重的障礙。在缺血性腦損傷中神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出壞死和凋亡兩種死亡形式，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生是治療缺血性腦血管病的重要著眼點(diǎn)。

Fig 2 Effect of PGSF on OGD/R-induced changes of MMP in PC12 cells

PC12細(xì)胞是大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，具有很多神經(jīng)細(xì)胞的特性，常代替神經(jīng)細(xì)胞用于研究。Na2S2O4為氧清除劑，起效迅速且不損傷細(xì)胞膜。Na2S2O4合并低糖常被用來(lái)構(gòu)建簡(jiǎn)單安全的的低氧低糖模型以用于實(shí)驗(yàn)研究［3］。本課題以此模型為基礎(chǔ)模擬腦缺血/再灌注損傷，從多個(gè)角度證明了PGSF對(duì)OGD/R處理的PC12細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。目前尚未見(jiàn)到其它關(guān)于PGSF對(duì)缺血/再灌損傷的作用方面的研究報(bào)道。

Fig 3 PGSF up-regulates ratio of Bcl-2/Bax proteins in PC12 cells injured by OGD/R

線粒體是細(xì)胞的產(chǎn)能供能中心，正常的MMP是維持線粒體功能所必需的。MMP下降是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的早期事件，是凋亡的特異性改變。OGD/R等因素可使線粒體內(nèi)外膜交界處存在的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔以高通透構(gòu)象持續(xù)性開(kāi)放，膜間隙正離子不斷進(jìn)入基質(zhì)，致使內(nèi)膜兩側(cè)電勢(shì)差減少，MMP下降或消失，線粒體腫脹，功能受損，細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)分子釋放到胞質(zhì)，最終激活Caspase家族成員介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［4］。JC-1能滲透到細(xì)胞器內(nèi)并與線粒體特異性結(jié)合，目前作為檢測(cè)MMP最好的熒光染料而被廣泛應(yīng)用［5－6］。在MMP較低時(shí)，JC-1以單體存在于胞質(zhì)，MMP較高時(shí)，JC-1形成聚合物聚集在線粒體基質(zhì)中，被激發(fā)后分別產(chǎn)生綠色和紅色熒光。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色即可判斷MMP的變化。

Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并與MMP的改變存在密切關(guān)系。文獻(xiàn)報(bào)道［7］，抗凋亡蛋白Bcl-2可能通過(guò)保持線粒體內(nèi)、外膜的完整性以及增加線粒體基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子的外流而抑制MMP的下降，還可通過(guò)與caspase-9等形成復(fù)合物而抑制caspase-3的激活。相反，促凋亡蛋白Bax等可轉(zhuǎn)位至線粒體而促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，誘導(dǎo)凋亡［8］。最終，Bcl-2和Bax通過(guò)影響細(xì)胞色素C的釋放而抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］。Bcl-2還可與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡效應(yīng)［10］，Bcl-2和Bax二者的比例對(duì)決定細(xì)胞的命運(yùn)發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果提示PGSF發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制與其抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，維持了MMP和細(xì)胞能量代謝的穩(wěn)定，最終阻斷了線粒體凋亡信號(hào)的啟動(dòng)，降低了細(xì)胞凋亡率。有關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究正在進(jìn)行中。

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