乳腺癌中C-erbB-2的表達及其與Ki-67的關系

翟雨佳 閆閃閃

人表皮生長因子2(C-erbB-2/HER-2/neu)是公認的乳腺癌標記物，也是指導臨床使用赫賽汀的惟一指標，Ki-67是一種在增殖細胞中表達的核抗原，是腫瘤增殖活性最重要的檢測指標［1，2］。本文用免疫組化(immunohistochemistry，IHC) 法檢測95例患者C-erbB-2和Ki-67蛋白的表達情況，探討乳腺癌中兩種蛋白表達的相關性及臨床意義。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集我院2007年11月至2011年臨床病理資料完整的乳腺癌病例95例，患者均為女性;年齡20～88歲，平均年齡53．1歲，中位年齡54歲。術前未行任何輔助治療(化療、內分泌治療、放療)，其中浸潤性小葉癌4例，黏液癌7例，浸潤性導管癌84例。

1．2 試劑 鼠抗人C-erbB-2單克隆抗體(即用型)、鼠抗人Ki-67單克隆抗體(即用型)及免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1．3 免疫組化

1．3．1 操作步驟:采用EnVision法檢測C-erbB-2，10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片(厚度4 μm)，貼于涂有多聚賴氨酸的玻片上，常規脫蠟至水，0．3%過氧化氫甲醇溶液滅活內源性過氧化物酶，高溫高壓修復抗原，其余步驟按試劑盒說明操作，用已知陽性切片作陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1．3．2 結果判讀:C-erbB-2蛋白的表達定位在細胞膜，無著色為(－)，任何比例的浸潤癌細胞呈現微弱、不完整的細胞膜著色為(+)，＞10%的浸潤癌細胞呈現弱至中等強度、完整但不均勻的細胞膜棕黃著色或≤30%的浸潤癌細胞呈現強且完整的細胞膜棕褐著色為(++)，＞30%的浸潤癌細胞呈現強的完整的細胞膜棕褐著色為(+++)［1］;Ki-67陽性為胞核著色，≤5%者為(－);陽性細胞數6% ～25%者為(+);26% ～50%者為(++);＞50%者為(+++)。

1．4 隨訪調查 對95例乳腺癌患者進行術后隨訪調查，記錄其手術日期、當前身體狀況或死亡日期。

1．5 統計學分析 應用SPSS 17．0統計軟件，C-erbB-2和Ki-67與臨床病理相關因素相關性的比較采用χ2檢驗，生存曲線用Log-rank檢驗，生存分析用COX比例風險回歸模型，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織中的表達 C-erbB-2蛋白的表達(－)的35例，(+)的32例，(++)11例，(+++)的17例。見表1，圖1～3。

2．2 Ki-67在乳腺癌組織中的表達 Ki-67蛋白表達(－)的12例，(+)的20例，(++)的42例，(+++)的21例。見表1、圖4 ～6。

2．3 C-erbB-2、Ki67蛋白表達與臨床病理因素關系 C-erbB-2和Ki-67與腫瘤大小及淋巴結轉移差異有統計學意義(P＜0．05)，而與年齡、病理分級和組織學分類差異無統計學意義(P ＞0．05)。見表1。

表1 癌組織中C-erbB-2和Ki-67蛋白表達與臨床病理因素關系 n=95，例

圖1 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織中+表達(免疫組化×200)

圖2 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織中++表達(免疫組化×200)

圖3 C-erbB-2蛋白在乳腺癌組織中+++表達(免疫組化×400)

2．4 C-erbB-2和Ki-67蛋白表達的相關性 C-erbB－2蛋白表達(－)的Ki-67(+)8例，(++)的20例，(+++)的為4例;C-erbB-2蛋白表達(+)的 Ki-67(+)7例，(++)的11例，(+++)的為9例;C-erbB-2蛋白表達(++)的 Ki-67(+)1例，(++)的4例，(+++)的為4例;C-erbB-2蛋白表達(+++)的Ki-67(+)4例，(++)的7例，(+++)的為4例。2組比較差異有統計學意義(P＜0．01)。見表2。

表2 乳腺癌組織中C-erbB-2和Ki-67蛋白關系的表達 例

圖4 Ki-67在乳腺癌組織中+表達(免疫組化×400)

圖5 Ki-67在乳腺癌組織中++表達(免疫組化×200)

圖6 Ki-67在乳腺癌組織中+++表達(免疫組化×400)

2．5 隨訪結果 95例隨訪結果:生存時間中位數29(5～59)個月;生存 78例，死亡或失訪 17例。用 Log-rank檢驗分析C-erbB-2和Ki-67蛋白表達的生存曲線表明:陰性者生存曲線高，5年無瘤生存率明顯高于陽性患者者(P＜0．05)。通過Cox比例風險回歸模型分析，結果顯示在臨床相關指標中淋巴結轉移與否和Ki-67、C-erbB-2蛋白是影響無瘤生存時間的危險因素。見表3。

表3 Cox回歸模型篩選的無瘤生存時間危險因素及參數估計

3 討論

人表皮生長因子2(human epidermal growth factor re-ceptor，HER-2/neu)是定位于人染色體17q12-21．3的癌基因，其蛋白(C-erbB-2)主要定位于細胞膜，是一種具有酪氨酸激酶活性的細胞膜受體，主要參與細胞生長的調控，促進腫瘤增殖及分化，與腫瘤的發生發展密切相關［2］。本實驗的95例中有28例發生了C-erbB-2的過表達(29．5%)，這與之前文獻報道的(20% ～30%)［3］相一致，進一步證明C-erbB-2的表達在乳腺癌發生發展中的作用。目前，國內外很多學者對乳腺癌組織中C-erbB-2的表達與臨床病理因素的相關性進行了研究，結果不盡相同［4］。本實驗發現在諸多臨床相關病理因素中，C-erbB-2與腫瘤大小和是否有淋巴結轉移有關(P＜0．05)。理論認為C-erbB-2參與細胞增殖及凋亡基因的調控，可以誘導細胞周蛋白D1表達增強，促進G1/S期進程，并且上調人端粒末端轉移酶逆轉錄酶(hTERT)，導致細胞端粒末端轉移酶異常活化，使細胞轉化并發生單克隆增生，形成腫瘤;還可通過Ras/MAPK途徑激活Smad7的啟動子使其高表達，干擾細胞的凋亡途徑使細胞永久增殖［5，6］。本實驗腫瘤相對大者，Cerb-B-2蛋白的高表達比率高，進一步證實了C-erbB-2在細胞增殖和逃避凋亡中的作用，但這一結果與Azizun等［6］的研究結論存在差異。本實驗結果中C-erbB-2與淋巴結的關系我們考慮可能是C-erbB-2能夠通過激活血管內皮生長因子(VEGF)啟動子增加VEGF在mRNA和蛋白水平的表達，而VEGF參與血管的生成，這在腫瘤的淋巴結轉移過程中起了非常重要的作用，但這僅僅是從單一方面解釋了這一結果的可能性，如果闡述詳盡準確的發生機制還需要更深入的研究。同時對本實驗預后數據的生存分析表明:C-erbB-2陽性表達的患者無瘤生存率低于陰性患者，即C-erbB-2過表達的患者無瘤生存期短，預后相對較差。同時COX比例風險回歸模型顯示:淋巴結轉移與否及C-erbB-2蛋白是影響患者無瘤生存時間的危險因素(P＜0．05)。那么綜合實驗范圍內各種因素，我們可以得出結論:C-erbB-2及淋巴結轉移可以做為判斷患者預后的重要指標。

Ki-67是反映細胞增殖指數的指標，由Gerdes等［7］于1991年作為非組蛋白的核蛋白鑒定出來，抗原表達在細胞核，在靜息細胞缺乏而腫瘤增殖細胞的各期均有表達［8］，是檢測腫瘤細胞增殖活性最為可靠的指標。本實驗中83例Ki-67有不同程度的增殖，增殖指數同患者腫瘤大小及是否有淋巴結轉移有關，腫瘤大者和有淋巴結轉移的患者，其Ki-67增殖指數高，而在不同的病理分級及組織學分類中其增殖表達沒有規律性，統計學顯示無差異，這同李寶江等［9，10］研究結果相同。對患者預后的生存分析及無瘤生存時間的危險因素統計結果顯示:Ki-67是影響患者無瘤生存時間的危險因素，其增殖指數高患者的生存時間短。同樣這一結果同C-erbB-2的表達結果呈正相關，即C-erbB-2表達越強，Ki-67增殖指數越高，且患者的預后差，術后生存時間短，這同Trihia等［11］研究結果一致。

1《乳腺癌HER-2檢測指南2009版》編寫組．乳腺癌HER-2檢測指南(2009 版)．中華病理學雜志，2009，38:836-840．

2 Molina R，Jo J，Filella X，et al．Mucin-1ike carcinoma associated antigen(MCA)in tissue and serum of patients with breast cancer:Clinical applications in prognosis and disease monitoring．Cancer Res，1994，32:89-95．

3 Lah T，Cercek M，Kos J，et al．Epidermal growth factor receptor(EGFR)，Her-2/Neu and cathepsins D．B and L as possible prognostic factors in breast carcinoma．Br Cancer Res Treat，1996，41:249-254．

4 Goueli BS，Janknecht R．Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81 and oncogenic HER2/Neu，Ras，or Raf．Mol Cell Biol，2004，24:25-35．

5 Dowdy SC，Mariani A，Janknecht R．HER2/neu and TAKl-mediated up-regulation of the transforming growth factor beta-inhibitor Smad7 via the ETS protein ER81．J Biol Chem，2003，278:44377-44384．

6 Azizun N，Bhurgri Y，Raza F，et al．Comparison of ER．PR and HER-2/neu(C-crbB-2)reactivity pattern with histologic grade，tumor size and lymph node status in breast cancer．Asia Pac J Caner Prev，2008，9:553-556．

7 Gerdes J，Lj L，Schlueter C，et al．Immunobiochemical and molecular bio-logic characterization of the cell proliferation-associated nuclear antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67．Am J Pathol，1991，138:867-873．

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9 李寶江，朱志華，王軍業，等．Ki-67，P53，VEGF和C-erbB-2在乳腺癌組織中表達的相關性研究及其臨床意義．癌癥，2004，23:1176-1179．

10 Bhatavdeker JM，Patel DD，Shah NG，et al．Prognostic significance of mmunohislochemically localized binmarkers in stageⅡand stageⅢbreast cancer:a multivariate analysis．Ann Surge Oncol，2000，7:305．

11 Trihia H，Murray S，Price K，et al．Ki-67 expression in breast carcinoma:Its association with grading systems，clinical paraneters，and other prognostic factors-a surrogate marker．Cancer，2003，97:1321-1331．