吳茱萸粉末醋調敷小鼠皮膚體外透皮吸收研究*

★ 歐水平 曹森 王森 雷小娟 袁濤 (.江西中醫學院 南昌 330004；2.成都中醫藥大學 成都 60075)

吳茱萸粉末醋調敷小鼠皮膚體外透皮吸收研究*

★ 歐水平1,2曹森1王森1**雷小娟1袁濤1(1.江西中醫學院 南昌 330004；2.成都中醫藥大學 成都 610075)

目的：考察吳茱萸粉末醋調敷小鼠皮膚的體外透皮吸收特性。方法：采用改良的Franz擴散池，以離體小鼠皮膚為透皮屏障，通過體外透皮吸收實驗，用高效液相色譜法檢測接收液和皮膚中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內酯的質量濃度，擬合滲透曲線方程，計算累積透過量、滲透速率、皮膚滯留量。結果：吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內酯的透皮吸收速率分別為0.64、0.44、4.91μg/(cm2·小時)，24小時累積透過量分別為15.05±2.40、10.69±1.04、114.16±6.83μg/cm2，24小時滯留量分別為0.77±0.42、1.66±0.81、4.97±0.69μg/cm2。結論：吳茱萸粉末醋調敷小鼠皮膚，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內酯均可透皮吸收，為吳茱萸醋調敷外治法的研究提供了實驗依據。

吳茱萸；透皮吸收；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；吳茱萸內酯

吳茱萸，粉末醋調外敷足心涌泉穴，取其滋陰降火、引熱下行，發揮藥物和穴位的雙重作用，用于降壓和改善高血壓癥狀，療效獨特[1]；研究表明，吳茱萸中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿具有降血壓的作用[2]；據文獻[3-5]報導及前期預實驗表明，吳茱萸堿和吳茱萸次堿具有一定的經皮滲透性，本實驗選取吳茱萸堿和吳茱萸次堿為指標成分，首次研究吳茱萸藥材粉末醋調敷豚鼠體外透皮吸收特性，并建立透皮樣品的高效液相色譜分析方法，為吳茱萸經皮給藥制劑的研究提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、色譜柱 Hypersil ODS2(5μm，4.6×250mm)(大連依利特，柱號：E2115011)、 TT-6B 透皮吸收試驗儀(配套改良Franz擴散池，S=1.7663cm2，V=12mL，天津市正通科技有限公司)、BP21ID Sartorius電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)、KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

吳茱萸堿對照品(批號：11802-200606)、吳茱萸次堿對照品(批號：11801-201006)均購于中國藥品生物制品檢定所。吳茱萸藥材(樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號：1105004)。乙腈、甲醇為色譜純，雙蒸水自制，其余試劑為分析純。山西陳醋為市售品(山西陳世家釀業有限責任公司 批號：2011/03/13)。

實驗動物：小白鼠，雄性4只，體重18-20g，江西中醫學院動物中心。

2 實驗方法

2.1 吳茱萸藥材前處理

將吳茱萸果實放入60℃烘箱中烘干至恒重，然后用藥材粉碎機將其粉碎成粉末，過篩，置干燥器中備用。

2.2 離體鼠皮的制備

將小鼠腹部毛小心剪去，處死后剪下腹部皮膚，小心剝離脂肪及粘液組織，選取完整皮膚，用生理鹽水反復沖洗干凈，冰箱貯存，1周內備用。

2.3 對照品溶液的配制

各取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內酯對照品約，精密稱定，分別加甲醇至mL定容，即得吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內酯對照品溶液母液，濃度分別為83.3、110.3、483.6μg/mL。

2.4 色譜條件

采用乙腈-水梯度洗脫，見表1，流速1.0mL/分、柱溫25℃、檢測波長225nm。

表1 梯度洗脫條件

2.5 吳茱萸藥材含量測定

取吳茱萸藥材粉末(過三號篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇25mL，稱定重量，浸泡1小時，超聲處理(功率100W，頻率40kHz)40分鐘，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，得供試品溶液[6]，按4項下條件精密量取20μL進樣測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內酯含量。

2.6 小鼠體外透皮吸收試驗

采用改良Franz擴散池，接收液為PEG400-95%乙醇-水(1∶3∶6)[4]。稱取1g 吳茱萸粉末(過120目篩)，用食醋3mL調成糊狀。將處理好的小鼠腹部皮膚3份，皮膚真皮面向接收池固定于擴散裝置的擴散室和接收室之間，在接收室中注滿接收液，排盡氣泡。磁力攪拌器轉速設定為350r/分，水浴溫度37℃±0.25℃，擴散池容積12mL，有效擴散面積為1.7663cm2。平衡半小時后，將上述吳茱萸糊緊密貼于皮膚表面，于1、2、4、8、12、24小時取樣，同時補充等量新鮮接受液取樣時將接收室中的液體全部倒出，經微孔濾膜濾過，即得透皮吸收液樣品。平行a、b、c三組空白皮膚樣品1份，同法操作。透皮實驗結束后，取下皮膚，用新鮮接收液清洗表面殘留物，濾紙吸干，剪碎后加入5mL甲醇超聲提取2次，每次30分鐘，取上清液用微孔濾膜濾過，得皮膚樣品。空白皮膚樣品1份同法操作。所得樣品按2.4項下條件精密量取20μL進樣測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內酯含量。

3 實驗結果

3.1 藥材有效成分含量

吳茱萸藥材中3種主成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內酯的質量百分數分別為0.779%、0.553%、1.300%，符合藥典規定。

3.2 體外經皮滲透性

藥物的累積透皮量Qn可由式1計算[7]：

其中，A為有效擴散面積，V為接受液總體積，Cn為第n次取樣時接受液中藥物的質量濃度，Ci為第i次取樣時接受液中藥物的質量濃度，Vi為取樣體積。以藥物的累積透過量Qn(μg/cm2)對取樣時間t作曲線(見圖1)，并由公式(2)對曲線中的直線部分進行線性回歸，求出的直線斜率即為穩態透皮速率Js (μg/(cm2·小時))，直線與x軸的交點為時滯tlag (小時)。

藥物的皮膚滯留量QS (μg/cm2)可由式3計算:

其中，A為有效擴散面積，V為皮膚提取液總體積，C為皮膚提取液中藥物的濃度。

吳茱萸醋調敷小鼠透皮成分經皮滲透性結果如下：

表2 體外透皮吸收結果

圖1 吳茱萸粉末醋調敷小鼠皮膚有效成分滲透曲線

4 小結與討論

由實驗結果可知，指標成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內酯透皮過程的線性規律明顯，透皮速率恒定，符合零級模型，滿足制成透皮制劑的前提條件。而本實驗中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的透皮吸收速率較小[8]，而且24小時累積透過量分別占藥材含量的1.4%和1.1%，說明皮膚屏障限制了藥物的透皮吸收，提示采用各種方法或手段促進有效成分的透皮吸收是提高吳茱萸透皮制劑血藥濃度的關鍵。

結合文獻報導[9]及透皮樣品在紫外-可見分光亮度計在200-400nm范圍內掃描，發現在225nm處有較大的紫外吸收，并且對目標成分的選擇性更好，所以本實驗選擇225nm做為檢測波長。并且本實驗也優化了流動相比例，使其洗脫能力更強，吳茱萸堿和吳茱萸次堿都能獲得基線分離。

實驗過程中發現，透皮樣品中吳茱萸生物堿成分性質不穩定，對光和熱敏感，試驗過程中易被破壞，導致含量測定時不易被檢出，不能長期保存，與文獻[10]報導一致，樣品應放在陰涼避光處保存，并在短期內完成檢測。應進一步研究生物堿成分不穩定的原因，以科學地指導實驗。

[1]馮松杰,陶興,韋政瑛.吳萸粉外敷涌泉穴治療腎性高血壓44例[J].中醫外治雜志,2001,10(1):44.

[2]嚴春臨,張季,薛貴平.中藥吳茱萸藥理作用研究概況[J].河北北方學院學報,2009,26(1):77-79.

[3]彭麗華,劉淑芝,郭春燕,等.兩種巴布劑基質的體外經皮滲透性考察[J].中國實驗方劑學雜志,2005,11(5): 1-3.

[4]杜茂波,劉淑芝,李曼玲,等.萸連巴布劑體外釋放和透皮行為的研究[J].中國中藥雜志,2009,34(8): 969-972.

[5]王冬梅, 李靜, 徐月紅,等. 寶瀉靈提取物的體外透皮吸收研究[J].中草藥,2007,38(10):1 487-1 490.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典﹒一部[S].北京：中國醫藥科技出版社,2010:160.

[7]鄭俊民.經皮給藥新劑型[M].北京:人民衛生出版社,2006.

[8]彭麗華.降壓巴布劑的透皮吸收與促滲劑篩選研究[D].北京:中國中醫研究院中藥研究所,2005.

[9]袁金斌,羅習珍,肖錫林,等.HPLC法測定吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量[J].現代生物醫學進展,2008,12(8):2 536-2 537.

[10]甄攀,楊風珍.吳茱萸總生物堿提取條件的考察[J].中國中藥雜志,2000, 25( 8) : 504-505.

江西省科技支撐計劃項目(項目編號：2010JX00095)；南昌市科技支撐計劃項目(項目編號：2010-KJZCJH-YYYYLQX-108)；江西省研究生創新專項資金項目(項目編號：YC2011-S111)。

**通訊作者：王森,Tel：0791-87118614，E-mail：wangsen912912@126.com。

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2013-05-17)