葡萄糖調節蛋白78促進肝硬化大鼠心肌細胞凋亡及其機制*

張麗麗， 龐 慧， 呂敏麗， 張慧英△， 賈建桃， 王黎敏， 劉 燕， 李旭炯， 李寶紅， 張翠英， 趙中夫， 韓德五， JI Cheng

(長治醫學院 1病理生理學教研室， 2免疫學教研室， 4機能實驗室， 5生理學教研室， 6肝病研究所，山西 長治 046000；山西醫科大學 3第二醫院ICU， 7肝病研究所，山西 太原 030001； 8美國南加州大學Keck醫學院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉磯 90089)

葡萄糖調節蛋白78促進肝硬化大鼠心肌細胞凋亡及其機制*

張麗麗1， 龐 慧2， 呂敏麗3， 張慧英1△， 賈建桃1， 王黎敏4， 劉 燕5， 李旭炯5， 李寶紅1， 張翠英5， 趙中夫6， 韓德五7， JI Cheng8

(長治醫學院1病理生理學教研室，2免疫學教研室，4機能實驗室，5生理學教研室，6肝病研究所，山西 長治 046000；山西醫科大學3第二醫院ICU，7肝病研究所，山西 太原 030001；8美國南加州大學Keck醫學院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉磯 90089)

目的探討葡萄糖調節蛋白78/免疫球蛋白重鏈結合蛋白(GRP78/BiP)是否促進肝硬化大鼠心肌細胞凋亡及其發生機制。方法采用復合致病因素法建立肝硬化大鼠模型，在4周、6周和8周分別取材。實驗1：取心臟稱重并測量左室壁厚度，計算左室壁厚度與心臟重量比值及心臟指數。實驗2： TUNEL法觀察心肌細胞凋亡情況；免疫組化方法檢測心肌組織中GRP78/BiP蛋白以及凋亡相關蛋白CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白/生長停滯及DNA誘導蛋白153(CHOP/GADD153)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)、核轉錄因子κB p65(NF-κB p65)、B細胞淋巴瘤/白血病蛋白2(Bcl-2)的表達。結果隨肝硬化病程進展，左室壁厚度與心臟重量比值以及心臟指數逐漸增加，8周組增加顯著(P<0.05)；心肌細胞凋亡指數、CHOP/GADD153和caspase-12陽性蛋白表達指數逐漸升高，8周組差異顯著(P<0.05)；NF-κB p65和Bcl-2陽性蛋白表達指數呈一致性變化，在4周組較其它組明顯增高(P<0.05)； GRP78/BiP蛋白陽性表達指數與心肌細胞凋亡指數、CHOP/GADD153、caspase-12蛋白陽性表達指數呈顯著正相關，CHOP/GADD153與NF-κB p65、Bcl-2蛋白陽性表達指數呈顯著負相關。結論GRP78高表達在內質網應激介導的肝硬化心肌病發病中可能發揮重要作用。

葡萄糖調節蛋白78； 內質網應激； 肝硬化心肌病； 細胞凋亡； 內毒素類

內質網應激誘導的凋亡是近年來發現的細胞凋亡途徑之一。有關內質網應激在肝硬化心肌病發病中的作用國內外鮮有報道。前期研究發現，肝硬化大鼠心肌收縮和舒張功能明顯降低，心肌細胞數量明顯減少，間質纖維明顯增加，內質網應激分子葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)/免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein,BiP)在其中可能起關鍵作用[1-2]。由于心肌細胞是終末分化細胞，而且是心肌收縮和舒張的最基本單位，因此其數量的減少勢必影響心臟功能，導致心力衰竭的發生和發展。本次研究我們首先對肝硬化大鼠心臟形態結構進行了觀察，進而對肝硬化心肌病發病過程中GRP78/BiP在心肌細胞數量減少中的作用及其機制進行了探討，旨在探索肝硬化心肌病發病的新機制，為臨床防治提供理論和實踐基礎。

材 料 和 方 法

1材料

脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)細胞凋亡原位檢測試劑盒購自凱基生物公司；GRP78/BiPⅠ抗購自Sigma；兔抗鼠核轉錄因子κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)、B細胞淋巴瘤/白血病蛋白2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及免疫組化染色試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司；CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白/生長停滯及DNA損傷誘導蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein/growth arrest and DNA damage-inducible protein 153,CHOP/GADD153)Ⅰ抗購自Santa Cruz。

2方法

2.1實驗1

2.1.1模型建立 清潔級成年雄性Wistar大鼠，體重200～240 g。正常對照組動物飼以標準飼料和礦物質水，采用復合致病因素法復制大鼠肝硬化模型[3]，于4周、6周、8周分別取材。

2.1.2大鼠左室壁厚度測量及計算 不同時點動物經麻醉后摘取心臟，稱重，繼而于主動脈弓至心尖部下1/3處橫斷切開心臟，固定距離和條件進行拍照。BI-2000顯微攝像系統下測量左室壁厚度(左室內膜與外膜最大距離)，計算左室壁厚度與心臟重量比值和心臟指數[心臟重量(mg)/體重(g)]，分別進行統計學分析。

2.2實驗2

2.2.1模型建立及各取材時點同2.1.1。

2.2.2心肌細胞凋亡檢測 采用TUNEL檢測法，原理如下：心肌細胞凋亡時染色質DNA發生斷裂，產生大量黏性3’-OH末端。在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶的介導下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA 3’-末端，借助生物素與親和素的特異結合，使過氧化物酶連接至DNA斷點，最后加入底物，通過DAB顯色，可在光鏡下觀察到細胞核呈棕褐色或棕黃色著色的凋亡細胞。檢測步驟按試劑盒操作說明書進行。

2.2.3心肌細胞凋亡指數的計算 應用BI-2000醫學圖像分析軟件，每張切片隨機選取10個視野(×400)，凋亡指數(apoptotic index, AI)以每個視野中凋亡細胞數占所觀察心肌細胞總數的百分比表示[AI(%)=凋亡細胞數/總計數細胞數×100%]，取平均值進行統計學分析。

2.2.4心肌組織GRP78/BiP、CHOP/GADD153、caspase-12、NF-κB p65和Bcl-2蛋白表達的檢測

① 免疫組化SABC法染色步驟 石蠟切片常規脫蠟水化，3%H2O2室溫下15 min滅活內源性酶，蒸餾水沖洗后枸櫞酸緩沖液熱修復抗原，PBS沖洗3次，滴加血清封閉液室溫下封閉20 min，分別滴加兔源性抗CHOP/GADD153、抗caspase-12、抗NF-κB p65和抗Bcl-2Ⅰ抗，濕盒內4℃過夜，PBS沖洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG室溫下20 min，PBS沖洗，滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物，室溫下放置20 min，PBS沖洗后以DAB顯色劑進行顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。

② 陽性表達指數(positive expression index,PEI)的計算 以上蛋白主要在胞漿中表達，胞質著棕黃色者為陽性，胞漿無棕色或與背景色一致者為陰性細胞。應用BI-2000醫學圖像分析系統，每張切片隨機選取10個視野(×400)，計數每個視野中陽性表達細胞數和細胞總數，計算各種蛋白的PEI[PEI(%)=陽性染色細胞數/總細胞數×100%]，取平均值進行統計學分析。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 10.0統計分析軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)、組間LSD-t檢驗和Pearson相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1肝硬化大鼠心臟形態結構變化

肝硬化大鼠隨病程進展左心室壁厚度與心臟重量比值及心臟指數均逐漸增加，以8周組增加最明顯，與同期對照組相比差異顯著，見表1。

表1 各組大鼠左室壁厚度與心臟重量比值及心臟指數

*P<0.05vscontrol.

2肝硬化大鼠心肌細胞凋亡

正常對照組的AI為(3.12±0.86)%，肝硬化4周組、6周組和8周組的AI分別為(5.82±1.27)%、(7.96±0.94)%和(16.52±1.46)%。8周組與其它3組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Apoptotic cells in rat myocardium (TUNEL, ×400). A： control; B： liver cirrhosis at 4 weeks； C： liver cirrhosis at 6 week； D： liver cirrhosis at 8 weeks.

圖1TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡

3肝硬化大鼠心肌組織GRP78/BiP蛋白的表達

正常對照組心肌細胞胞漿可見少量淺棕色顆粒。隨病程進展，模型組陽性顆粒明顯增多，染色加深。4周組、6周組和8周組的陽性表達指數分別為0.29±0.09、0.75±0.20和1.48±0.21，均顯著高于正常對照組(0.07±0.06；P<0.05),見圖2。

4凋亡相關分子CHOP/GADD153、caspase-12、NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表達

CHOP/GADD153、caspase-12和NF-κB p65在正常心肌組織均呈低表達。在肝硬化發病過程中，CHOP/GADD153和caspase-12的變化規律基本一致，蛋白表達均隨病程進展逐漸增加，8周增加顯著(P<0.05)；NF-κB p65蛋白在4周表達最高(P<0.05)，之后逐漸下降，但在8周仍高于正常對照水平；Bcl-2蛋白在4周表達最高，6周組和8周組依次降低，各組之間比較均有顯著差異(P<0.05)，見圖3、表2。

Figure 2. Expression of GRP78 protein in rat myocardium (immunohistochemical staining,×400). A: control； B: liver cirrhosis at 4 weeks； C: liver cirrhosis at 6 weeks； D: liver cirrhosis at 8 weeks.

圖2各組大鼠心肌GRP78蛋白表達

Figure 3. Expression of CHOP/GADD153,caspase-12,NF-κB p65 and Bcl-2 proteins in rat myocardium (immunohistochemical staining,×400).

圖3各組大鼠心肌CHOP/GADD153、caspase-12、NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表達

表2 CHOP/GADD153、caspase-12、NF-κB p65和Bcl-2蛋白的PEI值

*P<0.05vscontrol；#P<0.05,##P<0.01vs4 weeks;△P<0.05vs6 weeks.

5相關性分析

GRP78/BiP蛋白表達與凋亡指數、CHOP/GADD153及caspase-12進行相關分析，相關系數分別為0.769(P<0.01)、0.613及0.704(均P<0.05),呈顯著正相關。CHOP/GADD153與NF-κB p65和Bcl-2蛋白表達進行相關分析，其相關系數分別為-0.628和-0.583(均P<0.05),呈顯著負相關。

討 論

CHOP/GADD153是內質網應激促凋亡途徑中的重要信號分子[4],過度或持續的內質網應激會啟動細胞的凋亡程序。我們發現，CHOP/GADD153蛋白在正常心肌組織的表達微弱，而隨肝硬化病程進展逐漸增強，8周組表達最顯著，與GRP78/BiP的變化規律基本一致，且二者之間的變化呈顯著正相關，說明內質網應激促凋亡途徑中CHOP/GADD153的激活促進了心肌細胞的凋亡。目前認為CHOP/GADD153的促凋亡機制可能為：(1)直接激活下游的GADD34和TRB3，促進細胞死亡；(2)促進內質網氧化酶1α活化，激活內質網鈣通道，使Ca2+流入胞漿增加，啟動下游凋亡途徑；(3)通過調節Bcl-2蛋白家族發揮作用[4-6]。Bcl-2家族成員不僅存在于線粒體上，也定位于內質網膜和胞漿中；業已證實內質網應激時CHOP/GADD153蛋白可以通過直接抑制Bcl-2表達從而削弱其抗凋亡功能[5]。我們發現，隨肝硬化病情進展心肌組織中Bcl-2蛋白表達先增強后減弱，很可能與CHOP/GADD153蛋白表達增加有關。CHOP/GADD153還可誘導Bax和Bak構象變化和寡聚化，導致內質網膜完整性破壞、Ca2+外流，使胞漿內Ca2+濃度增高。Ca2+除了參與激活caspase-12以外，還可誘導線粒體PTP孔開放、細胞色素C釋放、凋亡執行蛋白caspase-3活化[5,7]，最終導致細胞死亡。本項研究發現，肝硬化大鼠心肌細胞凋亡指數隨病程進展逐漸增高，說明凋亡是引起心肌細胞數量減少的重要原因，也是肝硬化心肌病心臟形態和功能變化的基本機制；可見，在肝硬化發生發展過程中CHOP/GADD153是內質網應激促凋亡途徑的重要信號分子，而GRP78/BiP是該事件發生的關鍵性調節蛋白。

具有免疫和抗凋亡作用的轉錄因子NF-κB在內質網應激引起凋亡中的作用不容忽視。我們觀察到在肝硬化病程進展中NF-κB p65和Bcl-2表達在4周時最高，之后逐漸減弱，與CHOP/GADD153蛋白表達的變化方向相反。相關分析顯示，肝硬化8周時NF-κB p65和Bcl-2分別與CHOP/GADD153蛋白的高表達呈顯著負相關。NF-κB的活化在病變早期可能起到了細胞保護作用，后期CHOP/GADD153表達增強，削弱了NF-κB的抗凋亡作用。文獻報道，早期的內質網超負荷反應(endoplasmic reticulum overload response,EOR)可激活NF-κB[8]，早期磷酸化的PERK也可促進NF-κB的表達增加[9]，NF-κB可正向調節抗凋亡蛋白Bcl-2，從而激活細胞促生存途徑[9-10]，CHOP/GADD153可直接抑制Bcl-2的表達[5]。因而我們認為，內質網應激發生時先后激活了GRP78、NF-κB和CHOP/GADD153，NF-κB活化在內質網應激早期可能有重要的細胞保護作用，而在過度或持續的內質網應激時則通過促凋亡作用的加強和抗凋亡作用的減弱導致了心肌細胞凋亡。

Caspase-12是內質網應激啟動凋亡的另一重要信號分子[11]。生理情況下caspase-12與GRP78/BiP形成復合體以無活性狀態定位于內質網外膜，過度應激時二者解離，形成有活性的caspase-12[11]。Caspase-12也可以無活性形式與TNF受體相關因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)形成穩定的復合物，內質網應激時游離的肌醇必需酶1與TRAF2形成復合物促進了caspase-12的裂解、活化[12]，是TNF誘導細胞凋亡的重要機制[13]。Caspase-12一經活化，將相繼激活caspase-9和caspase-3，導致凋亡發生。以上事實證明caspase-12的活化是內質網應激誘導細胞凋亡的又一關鍵因素。我們發現，隨肝硬化病程進展心肌組織caspase-12蛋白表達逐漸增強，至8周組表達最顯著，而且與表達逐漸增高的GRP78/BiP蛋白呈顯著正相關，提示在大鼠肝硬化心肌病發病過程中，活化的caspase-12也是心肌細胞凋亡的重要調節分子。

心肌重構是病理情況下機體調動各種抗損傷因素對損傷心肌進行修復的結果，心肌細胞凋亡必然導致心肌的重構。臨床上，肝硬化心肌病患者的心臟結構改變通常發生在左心，表現為左心房壁變薄、腔增大和左室肥厚及腔增大[14]。本項研究中大鼠左室壁厚度與心臟重量比值增加以及心臟系數的增加，以及前期發現的心肌間質纖維增加[2]均充分說明肝硬化大鼠發生了心肌的重構。引起心肌重構的機制比較復雜，本模型中腸源性內毒素血癥及其誘導產生的以TNF-α為主的一系列因子以及GRP78/BiP高表達可能在心肌重構中發揮重要作用[15]，其確切作用機制有待進一步深入探討。

[1] 冀菁荃,張慧英, 賈建桃，等. 糖調節蛋白78 在大鼠腸源性內毒素血癥促進肝硬化形成中的作用[J]. 中國病理生理雜志，2010,26(12): 2447-2452．

[2] 張麗麗,呂敏麗,張慧英，等. GRP78 在肝硬化大鼠腸源性內毒素血癥引發心臟病變中的作用[J]. 中國病理生理雜志，2012,28(4): 577-582．

[3] Zhang HY, Han DW, Zhao ZF, et al. Multiple pathoge-nic factor-induced complications of cirrhosis in rats: a new model of hepatopulmonary syndrome with intestinal endotoxemia [J]. World J Gastroenterol, 2007,13(25):3500-3507.

[4] Nishitoh H. CHOP is a multifunctional transcription factor in the ER stress response [J]. J Biochem, 2012,151(3):217-219.

[5] McCullough KD, Martindale JL, Klotz LO，et al．Gadd153 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl2 and perturbing the cellular redox state [J]．Mol Cell Biol, 2001, 21(4)：1249-1259．

[6] Scull CM,Tabas I. Mechanisms of ER stress-induced apoptosis in atherosclerosis [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011,31(12):2792-2797.

[7] Tabas I, Ron D. Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress [J]. Nat Cell Biol, 2011,13(3): 184-190.

[8] Hamid T, Guo SZ, Kingery JR,et al. Cardiomyocyte NF-κB p65 promotes adverse remodeling, apoptosis, and endoplasmic reticulum stress in heart failure[J]. Cardiovasc Res, 2011, 89(1): 129-138.

[9] Jiang HY, Wek RC. Phosphorylation of the α-subunit of the eukaryotic initiation factor-2 (eIF2α) reduces protein synthesis and enhances apoptosis in response to proteasome inhibition[J]. J Biol Chem, 2005, 280(14):14189-14202.

[10] Nozaki S, Sledge-Jr Gw, Nakshatri H. Repression of GADD153/CHOP by NF-κB: a possible cellular defense against endoplasmic reticulum stress induced cell death[J]. Oncogene, 2001, 20(17): 2178-2185.

[11] Szeqezdi E, Fitzqerald U, Samali A. Caspase-12 and ER-stress-mediate apoptosis the story so far [J]. Ann N Y Acad Sci, 2003, 1010: 186-194.

[12] Jing G, Wang JJ, Zhang SX. ER stress and apoptosis: A new mechanism for retinal cell death[J]. Exp Diabetes Res, 2012,2012: 589589.

[13] Nishitoh H, Matsuzawa A, Tobiume K, et al. ASK1 is essential for endoplasmic reticulum stress-induced neuronal cell death triggered by expanded polyglutamine repeats [J]. Genes Dev, 2002,16(11):1345-1355.

[14] 宋香諄, 樸云峰,馮玉珍.肝硬化性心肌病的研究現況[J].臨床肝膽病雜志, 2007,23(4):317-319.

[15] Bradham WS, Bozkurt B, Gunasinghe H, et al. Tumoroh necrosis factor-alpha and myocardial remodeling in progression of heart failure a current perspective [J]. Cardiovasc Res, 2002,53(4):822-830.

Glucose-regulatedprotein78promotecardiomyocyteapoptosisinlivercirrhoticrats

ZHANG Li-li1, PANG Hui2, Lü Min-li3, ZHANG Hui-ying1, JIA Jian-tao1, WANG Li-min4, LIU Yan5, LI Xu-jiong5, LI Bao-hong1, ZHANG Cui-ying5, ZHAO Zhong-fu6, HAN De-wu7, JI Cheng8

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofImmunology,4FunctionalIntegrativeLaboratory,5DepartmentofPhysiology,6InstituteofHepatology,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China;3ICUoftheSecondHospital,7InstituteofHepatology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;8ResearchCenterforLiverDisease,KeckSchoolofMedicine,UniversityofSouthernCalifornia,LosAngeles,CA90089,USA.E-mail:zhanghy2001@163.com)

AIM: To explore the cardiomyocyte apoptosis induced by glucose-regulated protein 78/immunoglobulin heavy chain-binding protein (GRP78/BiP) in liver cirrhotic rats and its mechanism.METHODSThe liver cirrhotic rat model was established with multiple pathogenic factors, and sampled at the time points of 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks. In experiment 1, the heart was collected and weighed, the thickness of the left ventricular wall was measured, and the ratios of the left ventricular wall thickness to the heart weight, and the heart weight to the body weight were calculated. In experiment 2, TUNEL was used to detect the apoptotic cardiomyocytes,and the protein levels of GRP78/BiP, CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein/growth arrest and DNA damage-inducible protein 153 (CHOP/GADD153), caspase-12, nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) and B-cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2) in the myocar-dium were detected by the method of immunohistochemistry.RESULTSCompared with the normal myocardium, significant larger ratios of the left ventricular wall thickness to the heart weight and the heart weight to the body weight, a significant increase in the cardiomyocyte apoptosis, and a significant larger positive expression index of GRP78/BiP in the hearts 8 weeks after modeling were observed. The protein levels of CHOP/GADD153 and caspase-12 were gradually increased during the development of liver cirrhosis and were significantly increased at 8 weeks. The positive expression of NF-κB p65 and Bcl-2 showed consistent changes, and were markedly higher at 4 weeks than those at the other time points. The positive expression index of GRP78/BiP was positively correlated with the apoptotic index, and the levels of CHOP/GADD153 and caspase-12. The positive expression index of CHOP/GADD153 was negatively correlated with NF-κB p65 and Bcl-2.CONCLUSIONElevated expression of GRP78/BiP may play a crucial role in the pathogenesis of liver cirrhotic cardio-myopathy mediated by endoplasmic reticulum stress.

Glucose-regulated protein 78; Endoplasmic reticulum stress; Liver cirrhotic cardiomyopathy; Apoptosis; Endotoxins

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.031

1000- 4718(2013)05- 0941- 06

2012- 06- 28

2013- 03- 19

國家自然科學基金資助項目(No.81070339)；山西省國際科技合作計劃資助項目(No.2010081068)；山西醫科大學細胞生理學省部共建教育部重點實驗室主任基金資助項目(No.2010-09)；山西省回國留學人員科研基金資助項目(No.211-091)

△通訊作者Tel: 0355-3151441; E-mail: zhanghy2001@163.com