NOD8對LPS誘導巨噬細胞釋放NO、TNF-α和IL-1β的影響*

田 莉， 鄭媛媛， 胡巢鳳, 顏 亮

(暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局重點實驗室，廣東 廣州 510632)

NOD8對LPS誘導巨噬細胞釋放NO、TNF-α和IL-1β的影響*

田 莉▲， 鄭媛媛▲， 胡巢鳳△, 顏 亮

(暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局重點實驗室，廣東 廣州 510632)

目的探討NOD8對脂多糖(LPS)誘導巨噬細胞釋放一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)的影響。方法pEGFP-C2及pEGFP-NOD8重組質粒分別轉染小鼠巨噬細胞RAW264.7，以LPS刺激RAW264.7細胞0、6、12、24 h后，采用Griess reagent法測定觀察細胞分泌的NO水平；ELISA法檢測IL-1β 和 TNF-α 的含量；熒光法測定活化的caspase-1水平； Western blotting檢測NOD8蛋白表達及NF-κB p65亞基的核轉位情況。結果(1)與轉染pEGFP-C2空質粒組比較，轉染pEGFP-NOD8質粒組NOD8蛋白表達明顯增加。(2) LPS刺激6、12、24 h后，RAW264.7細胞釋放NO、IL-1β及TNF-α均明顯增加；而在pEGFP-NOD8+LPS組RAW264.7細胞， NO于12、24 h 的釋放顯著降低，IL-1β于6、12、24 h的釋放也明顯降低，TNF-α的釋放則無明顯變化。(3)在LPS刺激6、12、24 h后, RAW264.7細胞caspase-1活化水平均明顯升高，胞漿NF-κB p65亞基表達明顯減少，表明p65核轉位增加；而pEGFP-NOD8+LPS組可顯著抑制caspase-1的活化以及NF-κB p65亞基的核轉位，差異有統計學意義。結論NOD8可抑制LPS誘導的巨噬細胞NO與IL-1β釋放，其作用機制可能與NOD8抑制caspase-1及NF-κB 的活化有關。

RAW264.7細胞； 脂多糖類； NOD8蛋白； 核因子κB； 一氧化氮； 白細胞介素1β

哺乳動物的免疫系統是由固有免疫和適應性免疫組成,兩者之間通過相互影響、相互作用，共同高效率地消除機體感染的病原體微生物[1]。其中，固有免疫是機體抵御病原微生物感染的第一道防線,可以識別病原微生物在漫長的進化過程中共同的、高度保守的結構即病原體相關分子模式，可以識別它們的受體為模式識別受體[2]。NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)為胞漿內的模式識別受體。各種炎癥細胞尤其是巨噬細胞通過識別受體釋放促炎介質，導致炎癥反應[3]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激巨噬細胞產生的促炎因子在炎癥反應中發揮重要作用。白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)是介導炎癥反應的一種主要促炎因子；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)是炎癥反應過程中最早和初級內源性介質；一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種生物信使分子, 其生成依賴于誘導型一氧化化氮合酶(inducible nitric oxide synthase , iNOS)， 在抵抗入侵的細菌、真菌等微生物及在炎癥反應中起著十分重要的作用[3-4]。眾所周知，促炎癥介質的釋放主要是由NF-κB通路調控，NF-κB在調節炎癥和免疫反應時發揮極重要的作用。

目前在人類已發現20多個NLRs家族成員，NLRs家族成員的結構域主要有3個:中央的核苷酸結合區域(nucleotide-binding domain, NBD; 又稱為NOD區域)、C末端富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats, LRRs)及N末端的介導嗜同種蛋白-蛋白相互作用區域——caspase 募集區域(caspase recruitment domain, CARD)或pyrin區域(pyrin domain, PYD)[5]。NOD8與該家族的其它成員不同的是，由PYD結構域和NOD結構域組成， C末端缺乏作為配體識別區域的LRRs[6-8]。Imamura等[7]構建NOD8及炎癥相關因子重組質粒, 共轉染HEK293細胞，發現NOD8可抑 制由caspase-1 介 導 的IL-1β分 泌以及凋 亡 相 關斑 點 樣 蛋 白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)介導的NF-κB的活化和細胞凋亡 。為進一步探討NOD8在炎癥反應中的作用, 本實驗主要研究NOD8對LPS誘導巨噬細胞釋放炎癥因子的影響及可能機制。

材 料 和 方 法

1材料

質粒pEGFP-C2為本室保存；pEGFP-NOD8真核表達質粒由本課題組構建。小鼠巨噬細胞RAW264.7由南方醫科大學惠贈。

2主要試劑

細胞轉染所用的陽離子聚合物JetPRIME為Polyplus產品；DMEM細胞培養基、DPBS為Gibco產品；胎牛血清購自HyClone；細胞培養板為Corning Costar產品； BCA蛋白定量試劑盒為上海申能博彩生物公司產品；羊抗多克隆抗體購自Santa Cruz，兔抗多克隆單體購自CST,馬抗羊IgG抗體和羊抗兔IgG抗體購自鼎國生物公司；小鼠IL-1β ELISA試劑盒(R&D)；小鼠caspase-1檢測試劑盒(Biovision)；硝酸纖維素膜(Millipore)；濾紙(Bio-Rad)；考馬斯藍R-250、Tween-20、牛血清白蛋白、脫脂奶粉和SDA-PAGE凝膠配制試劑盒均購自南京碧云天公司；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3主要方法

3.1細胞培養及重組質粒轉染細胞 RAW264.7細胞采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，加入及1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，在37 ℃、5% CO2條件下進行細胞培養及傳代。RAW264.7細胞按5×107/L分別接種于24孔板內，待細胞生長至60%融合時進行轉染。將該JetPRIME/DNA復合物加入培養板，上下輕搖混勻,然后放置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。24 h后將培養板置于Olympus BX-51倒置熒光顯微鏡下，用488 nm波長紫外光激發,發射光波長為507 nm，觀察綠色熒光蛋白的表達。

3.2Western blotting檢測NOD8蛋白表達 收集轉染的或未轉染的RAW264.7細胞,用預冷的PBS洗3次，加入含100 g/L PMSF的細胞裂解液，冰上孵育30 min，離心15 min，收集上清。Bradford法檢測蛋白濃度，5% 濃縮膠、10% 分離膠分離蛋白后，將蛋白通過電轉移的方式轉移至硝酸纖維薄膜上，用特異性抗體檢測NOD8蛋白的表達，以GAPDH作為標準內參。結果用Bio-Rad圖像分析儀進行分析。

3.3Griess reagent 法測定NO2-的濃度 實驗分組：(1)陰性對照組(negative control, NC)；(2) pEGFP-C2對照組；(3) pEGFP-NOD8+LPS組；(4) pEGFP-C2+ LPS組。根據NO溶解于水后可以形成亞硝酸鹽的原理，測定培養基中亞硝酸鹽(NO2-)的含量，可以間接反應細胞上清中NO的含量。將RAW264.7細胞以5×104cells/well 密度接種在24孔細胞培養板上，培養過夜后，做轉染處理。在LPS刺激的0、6、12和24 h，分別提取各組的細胞上清液，檢測細胞上清中NO2-的濃度。檢測前將試劑從4 ℃冰箱中取出，置于室溫平衡30 min。亞硝酸鹽(nitrite)標準品梯度稀釋用來繪制標準曲線。稀釋的標準品以及待測細胞上清液均設3個復孔，按照操作說明書的步驟，測定酶標儀560 nm波長處吸光度(A)。根據標準曲線計算上清液中NO含量。

3.4ELISA法測定IL-1β和TNF-α含量 培養方法按3.1項，實驗分組按3.3項，收集細胞上清液備用。將IL-1β及TNF-α試劑盒從冰箱中取出放置室溫下平衡30 min。將標準品瞬時離心5 s，按照說明書，稀釋凍干標準品，將標準品成比稀釋為所需的濃度。按照IL-1β試劑盒的操作步驟，測量450 nm處的吸光度值；按照TNF-α試劑盒的說明，測量450 nm激發波長、570 nm發射波長處的吸光度值。處理數據，計算每一種樣品3個孔A值的平均值，參照標準曲線，計算出各組不同時點細胞培養上清液中IL-1β和TNF-α的含量。

3.5熒光法測定活化的caspase-1水平 培養方法按3.1項，實驗分組按3.3項，分別于 0 h、6 h、12 h、24 h消化、離心、收集各組細胞。用50 μL的細胞裂解液重懸細胞，冰上孵育10 min，然后加入96孔板中50 μL/well，依次加入含10 mmol/L DTT的2×Reaction Buffer 50 μL/well，1 mmol/L YVAD-AFC substrate 5 μL/well，然后置于37 ℃溫箱孵育1～2 h，熒光酶標儀400 nm激發波長、505 nm發射波長下測定各孔的熒光值，計算每一種樣品3個孔A值的平均值，將該值與對照組A值相比，計算出各組細胞樣品中活化caspase-1的相對值。

3.6Western blotting檢測巨噬細胞胞漿NF-κB亞基p65蛋白表達 按 3.5項分別收集各組不同時點的細胞，提取胞漿蛋白。胰酶消化收集細胞，用預冷的PBS清洗2次，細胞漿提取試劑I，漩渦混勻20 s，在冰上孵育10 min，再加入胞漿提取試劑II，4 ℃、16 000×g離心5 min，取上清,此提取物為胞漿成分，保存于-80 ℃備用，同時BCA測定蛋白濃度；Western blotting后續檢測蛋白表達。

4統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行分析處理。計數資料數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1轉染前后細胞狀態

轉染前及轉染后24 h，倒置顯微鏡下觀察RAW264.7細胞形態和數量上的變化。與轉染前相比，轉染后24 h內細胞的形態未發生明顯變化，但細胞的數量增多，密度增大,見圖1。

Figure 1. The cellular morphology before and after plasmids were transfected into RAW264.7 cells (×200). A: before transfection; B: 24 h after transfection.

圖1質粒轉染前和轉染后24hRAW264.7細胞情況

2NOD8蛋白在RAW264.7細胞中的表達

Western blotting檢測結果顯示，pEGFP-NOD8轉染組(0.0170±0.0019)與pEGFP-C2空質粒轉染組(0.0080±0.0007)相比，NOD8 蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義,見圖2。

Figure 2. NOD8 protein expression detected by Western blotting analysis.

圖2Westernblotting檢測NOD8蛋白的表達

3過表達NOD8抑制LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放

0、6、12及24 h,陰性對照組和pEGFP-C2對照組有少量NO釋放，而pEGFP-C2+LPS組隨著時間的延長，NO的釋放量逐漸升高，在24 h時NO的釋放量可達到(34.14±1.01)μmol/L。與pEGFP-C2+LPS組相比，pEGFP-NOD8+LPS組在6 h NO的釋放量無明顯變化(P>0.05)，在12 h 和24 h NO的釋放量明顯降低，差別有統計學意義，見圖3。

Figure 3. Effect of NOD8 on the release of NO in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC;**P<0.01vspEGFP-C2+LPS at the same time points.

圖3NOD8對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響

4過表達NOD8抑制LPS誘導的RAW264.7細胞IL-1β釋放

0、6、12、24 h,陰性對照組和pEGFP-C2對照組細胞上清中IL-1β的含量無明顯變化，而pEGFP-C2+LPS組隨時間的增加，IL-1β的濃度逐漸升高。與pEGFP-C2+LPS組相比，pEGFP-NOD8+LPS組在6 h、12 h 和24 h IL-1β的釋放量均明顯降低，差別有統計學意義，見圖4。

5過表達NOD8對LPS誘導RAW264.7細胞釋放TNF-α的影響

隨著時間的增加，陰性對照組和pEGFP-C2對照組細胞上清TNF-α的含量并無明顯增加，而pEGFP-C2+LPS組在6、12和24 h TNF-α釋放量均顯著增加， 各時點TNF-α的釋放量無明顯差異。pEGFP-NOD8+LPS組與pEGFP-C2+LPS組相比，6、12、24 h TNF-α濃度無明顯變化，差別無統計學意義(P>0.05),見圖5。

Figure 4. Effect of NOD8 on the production of IL-1β in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC;*P<0.05,**P<0.01vspEGFP-C2+LPS at the same time points.

圖4NOD8對LPS誘導RAW264.7細胞釋放IL-1β的影響

Figure 5. Effect of NOD8 on the release of TNF-α in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC.

圖5NOD8對LPS誘導RAW264.7細胞釋放TNF-α的影響

6過表達NOD8抑制LPS誘導的RAW264.7細胞caspase-1的活化

LPS刺激RAW264.7細胞6、12、24 h后caspase-1活化水平均明顯升高；與pEGFP-C2+LPS組相比，pEGFP-NOD8+LPS組caspase-1活化水平在各時點均顯著下降，且呈時間依賴性。而陰性對照組和pEGFP-C2對照組caspase-1活化水平在各時點無顯著差異(P>0.05),見圖6。

Figure 6. Effect of NOD8 on the activation of caspase-1 in LPS-induced RAW264.7 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC at the same time points;*P<0.05,**P<0.01vspEGFP-C2+LPS at the same time points.

圖6NOD8對LPS誘導RAW264.7細胞caspase-1活化水平的影響

7過表達NOD8抑制LPS誘導的RAW264.7細胞p65核轉位

Western blotting結果表明，正常情況下，p65主要存在于胞漿內； LPS刺激后，胞漿中的p65的蛋白表達在6、12和24 h逐漸減少，且呈時間依賴性。與pEGFP-C2+LPS組相比，pEGFP-NOD8+LPS組胞漿內的p65表達在6、12和24 h不斷增加，并呈時間依賴性。這說明NOD8可抑制LPS誘導的RAW264.7細胞 p65核轉位(P<0.01),見圖7。

討 論

近年來文獻報道有NLRs家族參與固有免疫、抵御病原體感染[9]。NLRs主要分布在胞漿內識別病原體相關分子模式和內源性分子[5, 10-14]。近年發現大部分NLRs可通過識別微生物，激活其信號轉導通路，募集吞噬細胞、導致炎癥介質的產生以及調控獲得性免疫反應。其中NOD1和NOD2分別識別細菌肽聚糖結構和胞壁酰二肽，誘導NF-κB的激活[6]。NLRs家族大部分成員具有促炎作用，但是近年來的研究表明NLRs家族部分成員起抗炎作用[15]。有報道指出，NLRP7可以抑制caspase-1介導的IL-1β加工，NLRP2可以抑制ASC介導的NF-κB的激活[16]。最近有研究表明NOD8轉基因小鼠受到鼠傷寒沙門菌感染時，IL-1β的表達并不增加[7]。對NOD8抗炎作用及機制的研究將為炎癥性疾病的防治開辟廣闊前景。

Figure 7. Effect of NOD8 on p65 protein expression in cytoplasm of RAW264.7 cells detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vspEGFP-C2+LPS at the same time points;##P<0.01vspEGFP-C+LPS (0 h).

圖7Westernblotting檢測NOD8對LPS誘導RAW264.7細胞胞漿p65表達的影響

LPS作為炎癥的強激活劑，可激活巨噬細胞，活化的巨噬細胞可以產生大量炎癥細胞因子如IL- 1β和TNF-α，引起iNOS 的表達增加，從而釋放大量具有組織損傷毒性的自由基NO等，導致強烈的氧化應激反應最終造成細胞的凋亡和壞死[4]。本研究通過NOD8對LPS誘導巨噬細胞釋放炎癥因子的影響，來探討NOD8在炎癥中的作用。結果發現，LPS刺激6、12、24 h后，RAW264.7細胞釋放NO、IL-1β 及TNF-α 均明顯增加；而在pEGFP-NOD8+LPS組, NO于12 h、24 h 的釋放顯著降低； IL-1β于6、12、24 h的釋放也明顯減少；而TNF-α 的釋放則無明顯變化。從上述結果我們可以發現，與pEGFP-C2+LPS組相比，pEGFP-NOD8+LPS組NO于6 h 的分泌量并無降低，分析其原因可能在于NO早期釋放較少。NOD8對TNF-α 的表達無顯著影響，這一現象可能與NOD8發揮作用的途徑有關。

通過構建NOD8和多種炎癥因子的質粒共轉染HEK293細胞后，發現 NOD8可以抑制caspase-1介導IL-1β的分泌和ASC-介導的NF-κB的活化和細胞凋亡[6]。進一步發現NOD8抑制caspase-1前體的催化活性是通過NOD結構域；NOD結構域通過抑制caspase-1前體的催化活性或caspase-1的自我寡聚化反應，抑制caspase-1的活化。另外，NOD8的PYD結構域可以抑制ASC介導的NF-κB的活化和細胞凋亡以及ASC增強caspase-1介導產生IL-1β的能力；NOD8的PYD結構域是ASC的一種生理抑制劑[17]，其可能通過阻止ASC聚集抑制ASC的多種功能[7]。但NOD8不能抑制由星形孢菌素、Fas配體以及TNF-α誘導HEK293T-Y細胞的細胞凋亡[6]；因此NOD8可能抑制caspase-1的活性和ASC介導的NF-κB激活及細胞凋亡而發揮抗炎活性。所以，我們接下來利用熒光檢測法檢測caspase-1的活化水平以及Western blotting檢測核因子亞基p65的核轉位，進一步探討NOD8在巨噬細胞炎癥中抑制炎癥因子的可能相關機制。結果證實NOD8可以抑制LPS誘導的巨噬細胞caspase-1的活化，且呈時間依賴效應。LPS刺激巨噬細胞后，胞漿中的p65蛋白表達在6、12和24 h逐漸減少。而pEGFP-NOD8+LPS組胞漿內的p65表達與pEGFP-C2+LPS組相比，p65核轉位在6、12、24 h逐漸減少，并呈時間依賴效應，說明NOD8可抑制LPS誘導RAW264.7細胞 p65核位移。綜上所述，說明NOD8可抑制LPS誘導巨噬細胞釋放NO和IL-1β，其作用機制可能是通過抑制caspase-1活化以及NF-κB p65亞基核轉位，抑制NF-κB活化，從而減少巨噬細胞炎癥因子的釋放。隨著對NOD8抗炎作用的深入研究，NOD8可作為炎癥性疾病治療的新靶點，將有助于預防和治療炎癥性疾病。

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EffectofNOD8onproductionofnitricoxide,IL-1βandTNF-αinLPS-treatedmacrophages

TIAN Li, ZHENG Yuan-yuan, HU Chao-feng, YAN Liang

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryforStateAdministrationofTraditionalChineseMedicineofthePeople’sRepublicofChina,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thcf@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of NOD8 on lipopolysaccharide (LPS)-induced releases of nitric oxide (NO), tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in RAW264.7 cells.METHODSThe plasmids of pEGFP-C2 and pEGFP-NOD8 were transfected into RAW264.7 cells respectively. The transfected and non-transfected cells were stimulated by LPS for 0, 6, 12 and 24 h. NO production was evaluated by Griess reagent assay, and the levels of IL-1β and TNF-α were measured by ELISA. The protein expression of NOD8 and the nuclear translocation of nuclear factor κB (NF-κB) p65 subunit were detected by Western blotting. The level of activated caspase-1 was determined by fluorimetric method.RESULTSCompared with pEGFP-C2 group, the protein expression of NOD8 was significantly elevated in pEGFP-NOD8+LPS group. The releases of NO, IL-1β and TNF-α were obviously increased after RAW264.7 cells were treated with LPS for 6 h, 12 h and 24 h, and while the secretion of NO was significantly reduced in the cells transfected with pEGFP-NOD8 and induced by LPS for 12 h and 24 h, and the release of IL-1β was also significantly reduced at 6 h, 12 h and 24 h. However, no significant difference of TNF-α release was observed between pEGFP-C2+LPS group and pEGFP-NOD8+LPS group. The activation of caspase-1 in RAW264.7 cells stimulated with LPS for 6 h, 12 h and 24 h was markedly increased, and the expression of NF-κB p65 subunit in the cytoplasm was significantly decreased, indicating that p65 nuclear translocation was increased. In addition, the activation of caspase-1 and the nuclear translocation of p65 were significantly inhibited in pEGFP-NOD8+LPS group.CONCLUSIONNOD8 suppresses the releases of LPS-induced NO and IL-1β in RAW264.7 cells by inhibiting the activation of caspase-1 and NF-κB.

RAW264.7 cells; Lipopolysaccharides; NOD8 protein; Nuclear factor-kappa B; Nitric oxide; Interleukin-1β

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.021

1000- 4718(2013)05- 0889- 06

2013- 01- 02

2013- 04- 10

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2012010008161)；暨南大學“211工程”三期預研項目；廣東省高等學校自然科學重點研究項目(No.05Z002)

△通訊作者 Tel: 020-85228079； E-mail: thcf@jnu.edu.cn

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