組蛋白的制備及其對巨噬細胞的影響*

付曉霞， 葉 萍， 李 雪， 鐘玙沄， 崔 航， 陳小歡， 蔡軍偉， 姜 勇， 劉靖華

(南方醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，廣東省功能蛋白質組學重點實驗室，廣東 廣州 510515)

組蛋白的制備及其對巨噬細胞的影響*

付曉霞， 葉 萍， 李 雪， 鐘玙沄， 崔 航， 陳小歡， 蔡軍偉， 姜 勇△， 劉靖華△

(南方醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，廣東省功能蛋白質組學重點實驗室，廣東 廣州 510515)

目的用不同方法制備組蛋白并觀察組蛋白在體外對巨噬細胞活力及細胞因子釋放的影響。方法用基因克隆的方法構建組蛋白H3和H4的原核表達質粒，分別表達和純化帶谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和組氨酸(His)標簽的組蛋白(GST-H3、GST-H4、His-H3和His-H4)；用高鹽法提取真核細胞(RAW264.7和293F細胞)組蛋白；用上述不同來源組蛋白(7.5～50 mg/L)刺激巨噬細胞4 h，利用MTT和流式細胞術檢測巨噬細胞活力；用液相芯片方法檢測不同來源組蛋白對巨噬細胞釋放在培養上清中的細胞因子白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度。結果His-H3/H4和真核細胞來源的組蛋白明顯降低細胞活性，誘導RAW264.7細胞發生晚期凋亡和壞死；不同來源組蛋白對RAW264.7細胞釋放IL-6和TNF-α均有不同程度的促進作用。結論原核表達His-H3、His-H4及真核細胞提取的組蛋白均可抑制巨噬細胞活力，誘導巨噬細胞發生晚期凋亡和壞死。組蛋白可能通過促進炎癥細胞因子的釋放參與了炎癥反應過程。

原核蛋白表達； 組蛋白類； 巨噬細胞

組蛋白(histone，H)是真核生物染色體的基本結構蛋白。組蛋白分子量較小(約10～20 kD)，富含帶正電荷的堿性氨基酸，能與DNA中帶負電荷的磷酸基團相互作用，共同組成染色體的基本單位。因氨基酸的成分和分子量不同，組蛋白主要分為H1、H2A、H2B、H3和H4五種，其中，H2A、H2B、H3和H4各2個分子組成組蛋白八聚體，由H1連接。DNA緊密纏繞在八聚體周圍形成染色質，限制DNA與其它活性物質的接觸。某些蛋白質能對組蛋白進行翻譯后修飾，從而調整核小體的結構，使DNA的易接觸性發生改變，通過這種方式來調節DNA的轉錄和復制。越來越多的研究結果表明，組蛋白的翻譯后修飾對基因的轉錄和表達發揮至關重要的作用[1-4]。

近來有研究發現，當細胞核中的組蛋白由于某種原因進入血液循環或者被釋放到細胞外時，可產生細胞毒性作用進而引起機體的反應。例如，有研究發現膿毒癥患者血液中組蛋白的濃度較高，H3達到15 mg/L，組蛋白很可能作為一種核內容物對機體造成損傷[5]。目前對其機制尚不清楚。本研究擬通過基因工程和提純的方法大量獲得組蛋白，為進一步研究組蛋白提供材料；利用獲取的組蛋白刺激巨噬細胞，通過觀察組蛋白對巨噬細胞活力及細胞因子釋放的影響，初步探討組蛋白對巨噬細胞的影響。

材 料 和 方 法

1主要實驗材料和儀器

DMEM培養基和PBS(Gibco)，胎牛血清(FBS)(Hyclone)，SFM培養基(Invitrogen)，細胞裂解液(CST)，LB培養基(Invitrogen)，MTT(Sigma)，多粘菌素B(Calbiochem)；瓊脂糖親和層析柱、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathioneS-transferase，GST)和組氨酸(histidine，His)標簽純化樹脂(Novagen)，切膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒(康為公司)，逆轉錄試劑盒(Toyobo)，細胞因子檢測試劑盒(Millipore)，引物合成由華大基因公司完成，CO2培養箱(Heraeus)，多光譜微孔板閱讀器M5(GE)，流式細胞儀(BD)，液相芯片工作站(Qiagen)。RAW264.7細胞株由本實驗室凍存。

2方法

2.1組蛋白原核表達質粒的構建

2.1.2原核表達質粒的構建 將表達載體pGEX-4T-1、pET-14b與PCR獲得的H3、H4片段雙酶切后回收并連接，連接反應體系是10 μL，反應條件為16 ℃，1 h。連接后將其轉化感受態大腸桿菌DH5α，鋪板，挑克隆，用PCR及雙酶切鑒定構建成功后送測序，確保質粒中H3和H4編碼序列正確。

2.2原核表達質粒的轉化、目的蛋白的表達及純化 質粒構建成功后，將其轉化感受態的大腸桿菌DE3(BL21)，鋪板，挑菌，擴增，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)(0.1 mmol/L)，25 ℃誘導表達18 h，收集細菌。帶GST標簽的組蛋白純化方法如下：收集細菌后，加GST緩沖液超聲裂解，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，留取上清，加入GST瓊脂糖珠，4 ℃孵育2 h，上清與純化樹脂充分結合后，將其置于親和層析柱中，用GST緩沖液清洗3次，洗脫蛋白。洗脫的蛋白用 PBS 透析3 次(每次8 h)，以去除谷胱甘肽，透析后的蛋白定量分裝。帶His標簽的組蛋白主要存在于包涵體中，故用尿素變性并按純化包涵體法進行純化。方法如下：收集細菌后，加His緩沖液超聲裂解，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清，用變性溶解緩沖液重懸沉淀后超聲裂解，離心后留取上清，加入His瓊脂糖珠，4 ℃孵育2 h，上清與純化樹脂充分結合后，將其置于親和層析柱中，用變性溶解緩沖液清洗3次，加適量變性洗脫緩沖液，用前加二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，使其終濃度為5 mmol/L，洗脫蛋白。然后依次用含8 mol/L、7 mol/L、6 mol/L、5 mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L和0 mol/L尿素的PBS緩沖液透析洗脫后的蛋白，每個濃度梯度透析6 h。透析結束后，離心并收集上清。將獲得的蛋白行15%SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍染色后分析純度。

2.3真核細胞組蛋白提取 真核細胞組蛋白的提取主要利用鹽提取法[6]。方法如下：培養RAW264.7細胞(同上)及293F細胞(SFM培養基，28 ℃，懸浮培養)，各收取1×107個細胞，冰PBS洗2次，加入1 mL含0.2% NP40的萃取液[10 mmol/L HEPES(pH 7.9)，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.34 mol/L 蔗糖，10% 甘油]，混勻細胞，冰上孵育10 min，離心5 min，棄除上清。用500 μL無NP40萃取液清洗3次沉淀，加入1 mL無鹽緩沖液(3 mmol/L EDTA，0.2 mmol/L EGTA)，漩渦振蕩1 min，置于4 ℃搖床30 min，取出后于4 ℃、6 500×g離心5 min，保留沉淀，加200 μL高鹽緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，2.5 mol/L NaCl，0.05% NP40]，振蕩2 min，至沉淀充分混勻，呈玻璃樣混濁，再次置于4 ℃搖床搖30 min，取出后4 ℃、16 000×g離心10 min，留取上清，將上清置于透析袋透析(pH 8.0的Tris-HCl溶液)，透析3次，每次1 h。透析結束后，4 ℃、16 000×g離心10 min，得到上清即為組蛋白。將獲得的蛋白行15%SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色后分析純度。

2.4MTT實驗 MTT實驗測定組蛋白對細胞活力的影響。取對數生長期的RAW264.7細胞，細胞計數后，接種于96孔培養皿中，調整細胞密度為1×104cells/well，設空白對照孔。培養24 h后，分別加入不同濃度的組蛋白刺激RAW264.7細胞(4h)，每組設5個復孔。孵育結束后，按10 μL/well加MTT溶液(終濃度5 g/L)，37 ℃孵育4 h，棄細胞培養液。加入二甲基亞砜100 μL/well，搖床上孵育10 min，于562 nm波長處測定吸光度(A)。細胞存活率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)。

2.5流式細胞術檢測 取對數生長期的細胞，接種于6孔板中，調整細胞密度為5×105cells/well。培養24 h后，分別用濃度為12.5、25和50 mg/L的His-H3刺激RAW 264.7細胞(4 h)。孵育結束后，用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和流式細胞術檢測細胞凋亡情況。每組收取(1～5)×105個細胞，用PBS洗2遍，加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻，室溫避光5～15 min，用流式細胞儀在激發波長488 nm、發射波長530 nm條件下檢測。

2.6細胞因子檢測實驗 分別用濃度為12.5、25和50 mg/L的組蛋白刺激RAW264.7細胞，同時用50 mg/L的GST處理細胞作為對照。為了排除LPS的影響，培養基中均加入多粘菌素B，濃度為10 mg/L。收集刺激后的培養上清，用液相芯片技術檢測上清中的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)的濃度[7]。

3統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，各組數據組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1pGEX-H3、pGEX-H4、pET-H3和pET-H4質粒的構建

ERCP模塊接收到自動制動手柄指令，給均衡風缸減壓到目標值；BPCP模塊響應均衡風缸壓力變化，制動管被減壓到均衡風缸目標壓力；16CP/DBTV模塊響應列車管減壓變化，給作用管充風；BCCP模塊響應作用管壓力增加，機車制動缸充風制動；同時車輛副風缸給車輛制動缸充風，車輛制動機制動。

PCR、酶切和測序結果表明pGEX-H3、pGEX-H4、pET-H3和pET-H4質粒構建成功。pGEX-H3和pGEX-H4的PCR和酶切鑒定結果見圖1。

Figure 1. Identification of pGEX-H3 and pGEX-H4 plasmids. M：DNA marker；1: H3 PCR product; 2: pGEX-4T-1 plasmid; 3: pGEX-H3 plasmid; 4: pGEX-H3BamH I/XhoI digestion product; 5: H4 PCR product; 6: pGEX-4T-1 plasmid; 7: pGEX-H4 plasmid; 8: pGEX-H4BamH I/XhoI digestion product.

圖1pGEX-H3和pGEX-H4重組質粒的PCR和酶切鑒定

2重組組蛋白及真核細胞中提取的組蛋白的電泳結果

15%SDS-PAGE電泳結果發現，His-H3蛋白大小為17 kD，His-H4蛋白為12 kD，GST-H3蛋白約43 kD，GST-H4蛋白約38 kD，與理論分子量基本一致，見圖2A。從真核細胞RAW264.7及293F中提取的組蛋白見圖2B，從上向下依次為H1、H3、H2A、H2B和H4。H1分子量約為35 kD，大于其理論分子量21 kD，可能與其在細胞內翻譯后修飾如甲基化、糖基化修飾有關[6]。在20 kD至11 kD處的蛋白分別為H3(理論分子量為17 kD)、H2A、H2B(理論分子量為14 kD)和H4(理論分子量為12 kD)。

3不同來源組蛋白致巨噬細胞活力下降

3.1MTT實驗結果 His-H3/H4、RAW264.7及293F細胞來源的組蛋白可明顯降低巨噬細胞活力(P<0.05)，并且刺激濃度越高，對細胞活力影響越大。GST-H3/H4對巨噬細胞活力影響不明顯(P>0.05)，見圖3。

Figure 2. Recombinant histones expressed by prokaryotic plasmids and histones extracted from eukaryotic cells. A: recombinant histones expressed by prokaryotic plasmids.M:protein marker; 1: His-H3; 2: His-H4; 3: GST-H3; 4: GST-H4. B: histones extracted from eukaryote cells: M: protein marker; 1:histones extracted from RAW264.7 cells;2:histones extracted from 293F cells.

圖2原核表達的組蛋白和真核細胞提取的組蛋白

Figure 3. Effects of histones on macrophage viability detected by MTT. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol group (0 mg/L).

圖3MTT實驗檢測組蛋白對巨噬細胞活力的影響

3.2流式細胞術結果 由圖4可見，組蛋白能誘導細胞發生晚期凋亡和壞死，結果與MTT實驗結果一致。對照組的細胞即正常細胞絕大多數處于第三象限；隨著His-H3刺激濃度的增加，第二象限即晚期凋亡或壞死細胞的數目增加，當His-H3的刺激濃度達到50 mg/L時，該象限細胞的比例達到65.0%(P<0.05)。

Figure 4. Effect of His-H3 on RAW264.7 cell apoptosis and necrosis.

圖4His-H3對RAW264.7細胞凋亡和壞死的影響

4組蛋白對RAW264.7細胞釋放炎癥因子的影響

由圖5可見，無論是原核來源的重組組蛋白還是真核細胞來源的組蛋白均能刺激RAW264.7細胞釋放炎癥因子TNF-α和IL-6。不同來源的組蛋白刺激細胞釋放的IL-6程度不同，GST-H3、GST-H4刺激RAW264.7細胞后釋放IL-6的水平較高。不同來源的組蛋白均可刺激RAW264.7細胞釋放較高水平的TNF-α。由于單獨使用GST蛋白對誘導RAW264.7細胞釋放TNFα和IL-6的作用不明顯，所以GST-H3和GST-H4刺激RAW264.7細胞釋放炎癥細胞因子的作用主要來源于組蛋白。

Figure 5. Effects of histones on the releases of IL-6 and TNF-α by RAW264.7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (0 mg/L).

圖5組蛋白對RAW264.7細胞釋放IL-6和TNF-α的影響

討 論

目前用于蛋白質的表達系統主要分為原核表達和真核表達系統。由于原核表達系統的蛋白表達周期短，表達量高而成為研究者首選的方法。本實驗中，我們利用原核表達系統表達了帶His和GST標簽的H3和H4，獲得了GST-H3、GST-H4、His-H3和His-H4融合蛋白。其中，GST-H3和GST-H4的可溶性好，純度高；His-H3和His-H4主要以包涵體形式出現，應用包涵體蛋白純化方法進行純化也獲得了成功。

由于原核表達系統是利用大腸桿菌表達蛋白質，大腸桿菌內沒有如真核細胞中相應的修飾酶，蛋白質的活性特別是蛋白質的修飾如糖基化、磷酸化和甲基化等可能受到影響。因此，根據研究的目標還需要真核來源的蛋白質。由于組蛋白在真核細胞的含量豐富，因而從真核細胞中提取組蛋白也成為獲取組蛋白的方法之一。從真核細胞里提取組蛋白的方法主要有2種，酸性提取法和高鹽提取法[6]。酸性提取法的基本原理是基于在強酸環境下，大多數核蛋白和核酸都可以沉淀[8]。自1983年組蛋白酸提取法[9]首次被提出以來，研究者結合其它一些技術方法如Western blotting、質譜等技術研究組蛋白及其修飾。但是也有一些組蛋白修飾具有酸不穩定性，即酸性環境會破壞某些組蛋白修飾[10]。所以后來又發展了高鹽提取法。該方法的主要優勢有:首先，是在整個提取過程中保持中性pH值，所以可保留有酸不穩定性的組蛋白修飾；其次，鹽提取法獲取的組蛋白得率比酸提取法高；第三，可差異分離各種組蛋白。本實驗采用了鹽提取法主要是為了保留組蛋白的修飾，使組蛋白更接近生理狀態。

在接下來觀察組蛋白對巨噬細胞活力影響的實驗中發現，無論是原核還是真核來源的組蛋白對巨噬細胞的活力都有不同程度的影響，MTT實驗和流式細胞實驗的結果一致。帶GST標簽的H3和H4對細胞活力影響不明顯，可能與GST對細胞有保護作用有關[11]，具體機制尚有待進一步實驗探索。盡管帶GST標簽的H3、H4對細胞活力影響不明顯，但是后續的實驗發現GST-H3/H4刺激巨噬細胞釋放炎性細胞因子的作用非常顯著，提示組蛋白至少可能通過影響細胞活力和促進細胞因子釋放2個環節參與炎癥反應過程。據報道，膿毒血癥過程中血液中組蛋白濃度急劇升高[5, 12]。盡管目前對這些組蛋白的來源尚無定論[13]，顯然，血液循環中的組蛋白通過對巨噬細胞的影響參與了膿毒血癥過程中放大(失控)的炎癥反應過程。

總之，本實驗不僅獲得了原核表達的組蛋白，而且從真核細胞中成功提取了組蛋白，這為以后大量獲取組蛋白提供了經驗，并為進一步研究組蛋白的調控機制奠定了基礎。本研究結果還表明，細胞外的組蛋白可能通過促進巨噬細胞釋放炎癥細胞因子參與了放大膿毒癥炎癥反應過程，是治療膿毒癥潛在的藥物靶點。本研究結果為進一步探索組蛋白的作用機制打下了基礎。

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訃告

中國病理生理學會第四屆理事，第五屆、六屆、七屆常務理事，第五屆實驗血液學專業委員會主任委員，實驗血液學雜志主編，我國著名實驗血液學家，原中國軍事醫學科學院副院長唐佩弦教授，因病于2013年4月12日去世，享年83歲。

唐佩弦教授為我國病理生理學事業的發展和學會的建設，特別是實驗血液學專業委員會和《中國實驗血液學雜志》的創建和發展做出了重大的貢獻。

中國病理生理學會在唐佩弦教授的追悼會上敬獻了花圈，以寄托我們的哀思。唐佩弦教授會永遠銘刻在我們心中。

中國病理生理學會

2013年4月16日

Preparationofhistonesandtheireffectsonmacrophages

FU Xiao-xia, YE Ping, LI Xue, ZHONG Yu-yun, CUI Hang, CHEN Xiao-huan, CAI Jun-wei, JIANG Yong, LIU Jing-hua

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofFunctionalProteomics,DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalCollege,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:liujhua@fimmu.com;jiang48231@163.com)

AIM: To prepare histones with different methods and to observe their effects on cell viability and cytokine release by macrophagesinvitro.METHODSProkaryotic expression plasmids of histone H3 and histone H4 were constructed by cloning methods. The histones containing GST-tag or His-tag (GST-H3, GST-H3, His-H3, His-H4) were expressed and purified. The histones from eukaryotic cells (RAW264.7 and 293F cells) were extracted with the high salt method. RAW264.7 cells were treated with histones (7.5～50 mg/L) for 4 h and the cell vitality was examined by MTT assay and flow cytometry. The concentrations of IL-6 and TNF-α in the culture supernatants of RAW264.7 cells treated with histones were also detected.RESULTSHis-H3/H4 and the histones from eukaryotic cells significantly reduced the viability of RAW264.7 cells and induced apoptosis. The effects of histones from different sources on the releases of IL-6 and TNF-α were different.CONCLUSIONHis-H3/His-H4 expressed by prokaryotic plasmids and the histones extracted from eukaryotic cells affect the vitality of macrophages as well as induce late apoptosis and necrosis. Histone may involve in the inflammatory process by promoting the release of inflammatory cytokines.

Prokaryotic protein expression; Histones; Macrophages

Q256

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.020

1000- 4718(2013)05- 0883- 06

2013- 03- 15

2013- 04- 02

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(No. 2010CB529704)；國家自然科學基金資助項目(No. 81272149；No.81072425)

△通訊作者 劉靖華 Tel： 020-61648172-810； E-mail: liujhua@fimmu.com； 姜勇 Tel： 020-61648231； E-mail: jiang48231@163.com