Ghrelin對腦缺血再灌注大鼠腦水腫和水通道蛋白4表達(dá)的影響*

賈增強(qiáng)， 王 來， 劉麗冰， 曾現(xiàn)偉△， 祝世功△

(1北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 北京 100191； 2濰坊醫(yī)學(xué)院， 山東 濰坊 261053)

Ghrelin對腦缺血再灌注大鼠腦水腫和水通道蛋白4表達(dá)的影響*

賈增強(qiáng)1,2， 王 來1， 劉麗冰2， 曾現(xiàn)偉2△， 祝世功1△

(1北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 北京 100191；2濰坊醫(yī)學(xué)院， 山東 濰坊 261053)

目的探討ghrelin對腦缺血再灌注大鼠腦水腫、血腦屏障通透性及水通道蛋白4(AQP4)表達(dá)的影響。方法成年SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組:sham組、大腦中動脈阻塞(MCAO)組和ghrelin處理組。采用線栓法復(fù)制MCAO模型(缺血2 h,再灌注22 h)。Ghrelin組大鼠于再灌開始時經(jīng)股靜脈注射ghrelin 10 nmol/kg。TTC染色觀察腦梗死體積，神經(jīng)功能評分判斷腦功能障礙程度，分別以體積計算和干濕重法檢測腦腫脹程度和腦含水量的變化，收集腦血管外伊文思藍(lán)(EB)來評估血腦屏障的破壞程度，免疫組化和Western blotting檢測AQP4的表達(dá)變化。結(jié)果與MCAO組比較，ghrelin處理組的腦梗死體積較小(P<0.01)，神經(jīng)功能評分較低(P<0.01)，腦組織中的EB滲出量較少(P<0.01)。Ghrelin處理組大鼠的腦腫脹體積、腦含水量和AQP4表達(dá)明顯低于MCAO組(P<0.05)。結(jié)論Ghrelin減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷，減輕腦水腫和血腦屏障的破壞，抑制腦組織中AQP4的表達(dá)。AQP4在ghrelin的腦保護(hù)機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。

缺血再灌注損傷； Ghrelin； 腦水腫； 水通道蛋白4； 血腦屏障

腦缺血缺氧是臨床上腦卒中患者致死致殘的主要病因，其不僅引起缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或壞死，還伴隨血腦屏障的破壞和腦水腫等一系列病理變化，腦水腫可導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，繼而擠壓非缺血區(qū)，影響其功能，還會促進(jìn)腦疝形成，嚴(yán)重威脅病人的生命。血腦屏障的破壞也是腦缺血后腦水腫形成的促進(jìn)因素。水通道蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水平衡和跨膜流動過程中發(fā)揮重要作用。目前已知有13個亞型，其中水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在腦組織表達(dá)最高，主要分布于腦微血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足和室管膜細(xì)胞上。具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)水流動的功能[1]。局灶性腦缺血再灌注實(shí)驗表明，AQP4基因敲除小鼠腦水腫的程度比野生小鼠明顯降低，神經(jīng)功能障礙程度也明顯減輕[2]。臨床腦梗死病人腦組織中AQP4的表達(dá)增多，并與腦缺血后腦水腫的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性[3]。以上研究均說明AQP4參與腦缺血再灌注引起的腦水腫形成過程。

Ghrelin 是由28個氨基酸組成的一種腦腸肽。前期研究表明，ghrelin可降低腦缺血再灌后的腦梗死體積[4]，具有神經(jīng)保護(hù)作用。但是，ghrelin 抗腦缺血再灌注損傷作用與AQP4的關(guān)系，以及對腦內(nèi)含水量、水腫體積和血腦屏障通透性的影響尚未見報道。

材 料 和 方 法

1動物分組及腦缺血再灌注模型復(fù)制

采用雄性、清潔級SD大鼠(由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗動物中心提供)，體重(290±10)g,單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水，室溫維持在20～25℃。 將45只大鼠，隨機(jī)分為sham組、大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)組和ghrelin處理組(ghrelin組)，每組15只。參照以前報道,采用線栓法復(fù)制大鼠MCAO缺血再灌注模型[5]，MCAO組與ghrelin組大鼠腦缺血2 h后,撤除栓線進(jìn)行再灌注22 h。Sham組的手術(shù)過程與MCAO組和ghrelin組相同，但栓線不插入大腦中動脈區(qū)域。Ghrelin組于再灌開始時通過股靜脈注射ghrelin 10 nmol/kg(Phoenix)，其它過程與缺血再灌注組相同。各組動物手術(shù)后24 h在水合氯醛麻醉下處死，分別進(jìn)行腦梗死體積測量、腦含水量測定、伊文思藍(lán)(Evans blue,EB)滲透量檢測、AQP4表達(dá)分布和AQP4蛋白電泳。每項需3只大鼠。

2神經(jīng)功能評分

參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分[6]。無神經(jīng)病學(xué)征象為0分；豎毛，輕度運(yùn)動低下為0.5分；前肢屈曲，有運(yùn)動障礙為1分；行動不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動為2分；偏癱，不能站立行走為3分；痙攣，昏睡為4分；死亡為5分。

3腦梗死體積觀察

處死動物后，取腦置于-20 ℃，冰凍5 min，然后，將腦組織由前向后冠狀切成2 mm組織片，并浸泡于0.5% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)磷酸緩沖液中，37 ℃避光孵育15～20 min，最后用4%多聚甲醛溶液固定。腦梗死體積按如下公式計算：梗死百分比(%)=(對側(cè)體積-缺血側(cè)未梗死體積)/對側(cè)體積 ×100%。

4腦水腫及含水量測定

處死動物，取腦，分別稱量缺血腦半球的濕重，然后將腦組織置于80 ℃干燥烤箱中烘烤24 h。將腦組織取出后立即稱量缺血腦半球的干重，然后按照以下公式進(jìn)行計算腦含水量和腦腫脹程度。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。腦腫脹體積百分比(%)=(缺血側(cè)體積-對側(cè)體積)/對側(cè)體積×100%。

5伊文思藍(lán)滲透量檢測

各組大鼠在麻醉處死前2 h股靜脈注射2% EB(4 mL/kg)。再灌注22 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠, 打開胸腔經(jīng)左心室插管灌注生理鹽水快速沖洗血管，斷頭取腦，將缺血側(cè)腦半球分離稱重，添加4 mL二甲基甲酰胺，50 ℃水浴30 min, 組織勻漿，12 500 r/min 離心30 min，取上清，在635 nm波長測吸光度，以計算腦組織內(nèi)EB含量(μg/g)。

6免疫組織化學(xué)法檢測AQP4的表達(dá)和分布

各組大鼠, 10%水合氯醛過量麻醉處死, 4%多聚甲醛灌流固定后取腦，常規(guī)制作10 μm冰凍切片，5% BSA室溫封閉30 mm，加兔抗AQP4抗體(1∶400, Santa Cruz)，4 ℃過夜，次日加HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗，DAB顯色。在光鏡下觀察。

7Westernblotting法測定AQP4表達(dá)

各組大鼠取腦后，加入RIPA裂解液(碧云天公司產(chǎn)品)，電動勻漿器勻漿，12 000 r/min，4 ℃ 離心30 min，取上清，BCA法(Thermo Fisher Scientific)定量蛋白濃度，10%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入兔抗AQP4抗體(Santa Cruz)和β-actin抗體(CST)，4 ℃過夜，加HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(中杉金橋公司)，ECL試劑盒(Millipore)顯色檢測蛋白條帶，以Quantity One軟件進(jìn)行圖像灰度值分析，以β-actin灰度值作為內(nèi)參照,校正各組AQP4的吸光度值。

8統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)和制作圖表，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1Ghrelin對腦梗死體積及神經(jīng)功能評分的影響

`TTC染色和梗死體積計算結(jié)果顯示，MCAO組出現(xiàn)較大的梗死灶(46.48%±3.12%)，ghrelin處理組的梗死灶(11.54%±2.98%)顯著小于MCAO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1A、B。神經(jīng)功能評分表明，MCAO組分?jǐn)?shù)(2.25±0.25)明顯高于ghrelin組(1.25±0.25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1C。

Figure 1. Effects of ghrelin on the infarct volume and the neurological function after cerebral ischemia/reperfusion. A: TTC staining; B: infarct volume; C: neurological score.Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsMCAO group.

圖1Ghrelin對缺血再灌注后腦梗死體積和神經(jīng)功能的影響

2Ghrelin對腦腫脹體積和腦含水量的影響

缺血2 h再灌注22 h后，MCAO組腦腫脹體積百分比(21.54%±2.98%)高于ghrelin組 (7.26%±3.08%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。腦含水量測定結(jié)果表明，MCAO組腦含水量(76.63%±0.58%)大于sham組(66.83%±0.29%) (P<0.01)，ghrelin組腦含水量(71.58%±0.30%)低于MCAO組(P<0.05)，見圖2B。

Figure 2. Effects of ghrelin on the brain swelling and water content after cerebral ischemia/reperfusion. A: volume of brain swelling; B: water content.Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham group;*P<0.05vsMCAO group.

圖2Ghrelin對缺血再灌注后腦腫脹程度和腦含水量的影響

3Ghrelin對伊文斯藍(lán)滲出量影響

血腦屏障破壞后，EB通過腦血管滲出到腦組織內(nèi)的含量增加，結(jié)果顯示，MCAO組腦組織內(nèi)EB的滲出量(27.33±2.03)明顯高于sham組(5.59±0.76)，差異顯著(P<0.01)。Ghrelin 組腦組織內(nèi)EB的滲出量(11.02±0.50)明顯低于MCAO組(P<0.01)，見圖3。

4Ghrelin對腦組織AQP4表達(dá)的影響

4.1Western blotting 如圖4所示，sham組大鼠腦組織中可見AQP4表達(dá)；MCAO組大鼠腦組織中AQP4的表達(dá)水平明顯高于sham組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);ghrelin組大鼠腦組織中AQP4的表達(dá)明顯低于MCAO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

4.2免疫組化染色 免疫組化結(jié)果表明,sham組大鼠腦皮層表達(dá)AQP4(圖5A)；MCAO組大鼠腦皮層高表達(dá)AQP4(圖5B);ghrelin組大鼠腦皮層的AQP4表達(dá)與sham組相近(圖5C)。其它腦區(qū)也有不同程度的AQP4表達(dá)(結(jié)果未顯示)。

Figure 3. Effect of ghrelin on Evans blue exudation content after cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsMCAO group.

圖3Ghrelin對缺血再灌注后EB滲出的影響

Figure 4. Effect of ghrelin on the expression of AQP4 after cerebral ischemia/reperfusion detected by Western blotting analysis.Mean±SD.n=3.#P<0.05vssham group;*P<0.05vsMCAO group.

圖4Westernblotting法檢測ghrelin對腦缺血再灌注大鼠腦組織AQP4表達(dá)的影響

討 論

腦水腫是腦缺血再灌后損傷的重要病理變化。腦缺血早期的腦水腫屬于細(xì)胞毒性腦水腫，主要是胞內(nèi)水鈉潴留引起細(xì)胞體積的增加，隨著時間推移，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檠茉葱阅X水腫。此時，微血管通透性增高，腦組織細(xì)胞間液膠體滲透壓升高，水由血管內(nèi)轉(zhuǎn)移至腦實(shí)質(zhì)，引起腦組織腫脹。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，AQP4具有調(diào)節(jié)腦水跨膜運(yùn)動和平衡的作用，參與細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫的形成[6]。基因敲除鼠的研究資料表明，在腦缺血再灌注的AQP4-/-小鼠，其神經(jīng)功能障礙和腦水腫程度都比野生型小鼠輕[2]，說明腦組織中AQP4的表達(dá)水平與腦缺血后腦水腫的形成密切相關(guān)。因此，AQP4的調(diào)節(jié)及與腦缺血后腦水腫形成關(guān)系受到高度關(guān)注。

Figure 5. Effect of ghrelin on the expression of AQP4 in rat cortex after cerebral ischemia/reperfusion detected by immunohistochemistry analysis (×200; inside,×400). A: sham group; B: MCAO group; C: ghrelin group.

圖5免疫組化法檢測ghrelin對缺血再灌注大鼠腦皮層AQP4表達(dá)的影響

Ghrelin是近些年發(fā)現(xiàn)的一種腦腸肽，不僅參與飲食、血壓等生理功能的調(diào)節(jié)[7-8]，而且具有抗損傷和細(xì)胞保護(hù)作用[9-11]。本實(shí)驗室的前期工作也發(fā)現(xiàn)，ghrelin通過上調(diào)Bcl-2和HSP70的表達(dá)降低腦缺血再灌后引起的腦組織損傷[12]。Lopez等[13]利用腦創(chuàng)傷模型研究發(fā)現(xiàn)，外源性ghrelin可以減輕血腦屏障的破壞和腦水腫，并與降低腦血管周圍AQP4表達(dá)相關(guān)。但有關(guān)ghrelin與缺血后腦水腫及AQP4表達(dá)之間關(guān)系尚未見研究報道。本實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血后開始再灌注時給予ghrelin，不但可顯著降低腦梗死體積和神經(jīng)功能障礙，而且能顯著減輕腦水腫和缺血再灌注引起的血腦屏障破壞，提示ghrelin 可從多個環(huán)節(jié)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。不僅在血管源性水腫階段發(fā)揮防止水分向組織滲透的功能，而且對于維持血腦屏障通透性的穩(wěn)定具有一定作用。腦水腫和血腦屏障破壞的減輕可減緩因腦缺血再灌注造成的顱內(nèi)壓升高，避免腦組織的二次損傷，對于減輕并發(fā)癥，降低死亡率具有重要意義。AQP4是腦組織中表達(dá)最高的水通道蛋白，主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞上，參與腦水轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)驗結(jié)果表明， MCAO大鼠腦中AQP4高表達(dá)，而在ghrelin處理組大鼠腦中低表達(dá)，說明ghrelin對于AQP4的表達(dá)具有抑制作用。這一作用很可能是ghrelin抗腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制環(huán)節(jié)，值得深入研究。

[1] Badaut J, Lasbennes F, Magistretti PJ, et al. Aquaporin in brain: distribution, physiology, and Pathophysiology [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2002,22(4):367-378.

[2] Manley GT, Fujimura M, Ma T, et al. Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke [J]. Nat Med, 2000,6(2):159-163.

[3] Aoki K, Uchihara T, Tsuchiya K, et al. Enhanced expression of aquaporin 4 in human brain with infarction[J]. Acta Neuropathol, 2003,106(2):121-124.

[4] Miao Y, Xia Q, Hou Z, et al. Ghrelin protects cortical neuron against focal ischemia/reperfusion in rats [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007,359(3):795-800.

[5] 趙 瑾，李 楊，黃 磊，等. 肢體缺血后適應(yīng)對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制[J].中國病理生理雜志,2010,26(6): 1096-1101.

[6] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.

[7] Iacovetta C, Rudloff E, Kirby R. The role of aquaporin 4 in the brain[J]. Vet Clin Pathol, 2012, 41(1):32-44.

[8] Nakazato M, Murakami N, Date Y, et al. A role for ghrelin in the central regulation of feeding [J]. Nature, 2001,409(6817):194-198.

[9] 王越暉,祝世功. Ghrelin的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展[J]. 中國病理生理雜志, 2001, 17(12):1256-1259.

[10] Wiley KE, Davenport AP. Comparison of vasodilators in human internal mammary artery: ghrelin is a potent physiological antagonist of endothelin-1[J]. Br J Pharmacol, 2002 ,136(8):1146-1152.

[11] Chung H, Kim E, Lee DH, et al. Ghrelin inhibits apoptosis in hypothalamic neuronal cells during oxygen-glucose deprivation[J]. Endocrinology, 2007,148(1):148-159.

[12] Yang M, Hu S, Wu B, et al. Ghrelin inhibits apoptosis signal-regulating kinase 1 activity via upregulating heat-shock protein 70[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007,359(2):373-378.

[13] Lopez NE, Krzyzaniak MJ, Blow C, et al. Ghrelin prevents disruption of the blood-brain barrier after traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma, 2012,29(2):385-393.

Effectsofghrelinonbrainedemaandaquaporin4expressionaftercerebralischemia/reperfusioninrats

JIA Zeng-qiang1,2, WANG Lai1, LIU Li-bing2, ZENG Xian-wei2, ZHU Shi-gong1

(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100191,China;2WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China.E-mail:sgzhu@bjmu.edu.cn;zengxwei@163.com)

AIM: To explore the effects of ghrelin on the brain edema, the permeability of blood-brain barrier (BBB) and the expression of aquaporin 4 (AQP4) after cerebral ischemia/reperfusion in rats.METHODSAdult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, middle cerebral artery occlusion (MCAO) group and ghrelin treatment group. The MCAO model was made with nylon thread for 2 h of occlusion following 22 h of reperfusion. Ghrelin at a dose of 10 nmol/kg was injected via femoral vein at the beginning of reperfusion. The cerebral infarct volume was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. Brain functional deficits were evaluated by determining the neurological scores. The changes of brain swelling and water content were analyzed through volume calculation and dry/wet weight measurement. The permeability of BBB was detected by collecting extravascular Evans blue (EB) in the brain cortex. The changes of AQP4 expression were assessed by the methods of immunohistochemistry and Western blotting.RESULTSCompared with MCAO group, the rats in ghrelin treatment group had smaller brain infarct volume, lower EB exudation content and neurological scores. The percentage of brain swelling, water content and AQP4 expression were lower in ghrelin treatment group than those in MCAO group.CONCLUSIONGhrelin reduces the injury of cerebral ischemia/reperfusion, and lightens the brain edema and BBB damage in rats. Ghrelin also inhibits the expression of AQP4 in brain tissue.

Ischemia-reperfusion injury; Ghrelin; Brain edema; Aguaporin 4; Blood-brain barrier

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.017

1000- 4718(2013)05- 0867- 05

2013- 03- 08

2013- 03- 21

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30871034; No.81171081)

△通迅作者 曾現(xiàn)偉 Tel: 053-68068830; E-mail: zengxwei@163.com; 祝世功 Tel: 010-82801477; E-mail: sgzhu@bjmu.edu.cn