宮頸癌組織APOBEC3A蛋白的表達與高危型HPV感染的相關性研究*

陳 姍， 狄 娜， 秦君璞， 鄭婷婷， 李 丹， 周 莉， 張帝開△

(1中山大學附屬第六醫院婦產科，廣東 廣州 510655； 2中山大學附屬第二醫院婦產科，廣東 廣州 510120 )

宮頸癌組織APOBEC3A蛋白的表達與高危型HPV感染的相關性研究*

陳 姍1， 狄 娜2， 秦君璞1， 鄭婷婷1， 李 丹1， 周 莉1， 張帝開1△

(1中山大學附屬第六醫院婦產科，廣東 廣州 510655；2中山大學附屬第二醫院婦產科，廣東 廣州 510120 )

目的探討宮頸癌組織中載脂蛋白 B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3A(APOBEC3A)表達與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染的關系。方法采用免疫組化法檢測26例宮頸癌、27例宮頸上皮內瘤變(CIN)I～III和22例正常宮頸組織APOBEC3A蛋白的表達，同時使用凱普分型檢測試劑盒對3組樣品分別進行高危HPV16/HPV18分型檢測。以脂質體法轉染APOBEC3A質粒進入HeLa細胞，RT-qPCR與Western blotting驗證APOBEC3A對高危型HPV18 E6 mRNA以及蛋白表達的影響。結果宮頸癌組織、CIN組織以及正常宮頸組織中APOBEC3A蛋白表達的陽性率分別為46.2%、92.6%和86.4%，宮頸癌組織中APOBEC3A蛋白表達較正常宮頸組織明顯下降(P<0.01)。宮頸癌組織、CIN及正常宮頸組織中HPV16感染陽性率分別為92.3%、77.8%和54.5%； HPV18感染陽性率分別為80.8%、51.8%和68.2%；APOBEC3A蛋白表達與HPV18感染陽性率呈負相關(P<0.05)。增加HeLa細胞中APOBEC3A的表達明顯降低了HPV18 E6 mRNA以及蛋白的表達。結論在宮頸癌組織中APOBEC3A高表達可以對抗HPV18感染，并抑制HPV18 E6的轉錄和表達。

載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3A； 人乳頭狀瘤病毒； 宮頸腫瘤

載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白(apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide-like protein，APOBEC)是哺乳動物所特有的胞嘧啶脫氨酶，是一種內源性抗病毒蛋白。至今為止發現人來源的APOBEC家族成員包括APOBEC1、APOBEC2、AID(activation-induced deaminase)、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3DE、APOBEC3F、APOBEC3H和APOBEC4[1]。APOBEC家族蛋白對多種病毒具有抑制或超突變作用，包括人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)[2]、猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)[3]、泡沫病毒(foamy virus，FV)[4]、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)[5]以及腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)[6]等多種病毒。 最近研究還發現APOBEC3A、APOBEC3C和APOBEC3H對人乳頭瘤病毒(human papilloma viruse，HPV) DNA具有高突變的編輯作用[7]。而高危型HPV的持續性感染是宮頸癌發生發展的必然因素[8]，其中高危型HPV16和HPV18的感染率在宮頸癌病例中占70.1%[9]。高危型HPV E6致癌基因在宮頸癌的發生發展中起著非常重要的作用，它通過與抑癌基因p53作用而抑制細胞凋亡[10]，使宮頸上皮細胞永生化最終發展成為惡性腫瘤。本研究在宮頸癌、癌前病變和正常宮頸組織中通過免疫組化法檢測APOBEC3A蛋白的表達，高危分型試劑盒檢測HPV16和HPV18感染的情況，初步探討APOBEC3A與HPV16/18感染的關系；再構建APOBEC3A質粒，轉染宮頸癌HeLa細胞株，觀察APOBEC3A對HPV18 E6表達的影響。

材 料 和 方 法

1病人資料

收集2008年～2012年中山大學附屬第六醫院住院初治的宮頸癌患者26例(宮頸癌組)、宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)I～III患者27例(CIN組)和正常宮頸患者22例(正常宮頸組)，標本予石蠟包埋，均經病理組織學明確診斷。(1)宮頸癌組：患者年齡34～70歲，中位年齡51歲。分期采用國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO) 2009年臨床分期標準。入組標準：我院初治，病理確診為宮頸癌；IA～IIB；在我院接受廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結清除術；術前未經放療、化療或生物免疫治療；無合并或繼發第2癌。(2)CIN組：年齡26～52歲，中位年齡39歲，為同期在我院因CIN行宮頸錐切術的患者。(3)正常宮頸組：年齡29～50歲，中位年齡41歲，為同期因子宮肌瘤在我院行全子宮切除術的患者，術后病理確診宮頸無病變。

2載體、菌株和細胞株

含有APOBEC3A ORF的質粒(命名為A3A質粒)以及對照空質粒M45由復能基因公司提供。HeLa細胞株購自中國社科院細胞庫，大腸桿菌株DH5α購自大連TaKaRa公司。

3主要試劑

抗APOBEC3A多抗Anti-PHO1 antibody (ab38641)購自Abcam，II抗山羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化酶多聚體購自北京中杉金橋生物有限公司。HPV基因分型檢測試劑盒購自中國凱普生物科技有限公司。 RNA 提取試劑 TRIzol 和細胞培養基DMEM 購自 Gibco, Lipofectamine? LTX and Plus Reagents試劑盒以及逆轉錄酶 M-MLV購自lnvitrogen, Power SYBR Green PCR Master Mix購自Life Technologies。鼠抗HPV16 E6+HPV18 E6單克隆IgG抗體(sc-460)購自Santa Cruz，兔抗APOBEC3A多克隆IgG抗體(ab38641) 購自Abcam，β-actin抗體購自PTG，羊抗鼠IRDye800 II抗和羊抗兔IRDye680 II抗購自LI-COR，T-PER 蛋白提取試劑購自Thermo。

4主要方法

4.1宮頸組織APOBEC3A蛋白檢測 75例患者的存檔蠟塊切片4 mm采用免疫組化非生物素二步法檢測。用微波爐檸檬酸液pH 6.0修復抗原，I抗工作濃度為1∶40，II抗工作濃度為1∶100，DAB顯色，蘇木精復染，用PBS代替I抗作陰性對照。

4.2免疫組化檢測結果判斷 所有切片采用盲法由2位病理科醫生獨立閱片，進行免疫組化半定量分析。 隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，根據其中陽性細胞的比率和染色深度分別進行評估陽性細胞的比率評分：0分為陽性細胞數占總細胞數0～25%，1分為陽性細胞數占總細胞數26%～50%，2分為陽性細胞數占總細胞數51%～75%，3分為陽性細胞數占總細胞數76%～100%。染色深度評分：0 分為無染色，1分為淡黃色，3分為黃色至棕黃色，2分為染色強度介于1～3分之間。總積分=陽性細胞比率評分×染色強度評分。0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中強陽性(++)，6分為強陽性(+++)。以2分以上判定該標本為陽性表達，陽性率(%)=陽性表達的標本數/總標本數×100%。

4.3HPV分型檢測 每個患者在手術前使用凱普試劑盒進行HPV分型檢測， 步驟主要包括：HPV DNA提取、HPV PCR擴增、核酸分子快速導流雜交和顯色HPV基因分型。操作和結果判讀按試劑盒要求進行，檢測宮頸細胞感染HPV16以及HPV18亞型的情況。

4.4細胞培養和轉染 HeLa細胞在DMEM培養基 (含10%FBS)、37 ℃、5%CO2、100%相對濕度條件下常規培養。HeLa細胞轉染A3A質粒作為實驗組，轉染M45空質粒作為對照組，使用Lipofectamine? LTX and Plus Reagents試劑盒進行轉染HeLa細胞后繼續培養，設定平行實驗3個復孔。

4.5實時熒光定量PCR檢測 轉染后48 h，用TRIzol試劑分別提取實驗組和對照組HeLa細胞的總RNA, 分光光度法測定計算總RNA含量及濃度，各取500 ng RNA, 按照逆轉錄酶M-MLV說明書進行逆轉錄, 再取等體積cDNA 模板，加入HPV18 E6引物或APOBEC3A引物以及SYBR Green熒光染料，在Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀上進行半定量PCR分析，條件如下： 50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，60 ℃ 30 s，40 個循環。以β-actin作為內參照。所用引物由上海英駿技術有限公司根據設計合成，見表1。

表1 引物序列

4.6蛋白印跡法(Western blotting)檢測 在轉染48 h后，分別用T-PER 蛋白提取法提取實驗組、對照組和未處理組的細胞總蛋白, 測定蛋白濃度后取50 μg 蛋白上樣, 用Western blotting 檢測細胞中APOBEC3A、 HPV18 E6以及β-actin蛋白的表達量。具體方法如下：蛋白經 SDS-PAGE電泳80 V約 30 min，待溴酚藍染料到達分離膠與積層膠交界處時，改以 120 V 電泳 40～60 min， 60 V電泳1.5 h轉移至硝酸纖維膜(NC膜)，3%脫脂奶37 ℃ 封閉1 h，I抗(1∶100) 4 ℃ 過夜, 相應II抗(1∶10 000) 37 ℃ 孵育1 h，NC 膜直接放在 LI-COR Odyssey 紅外熒光掃描儀，按說明書進行圖像雙色分析，用相對灰度值表示蛋白相對含量。同時檢測β-actin (1∶10 000)的表達作為內參照。

5統計學處理

結 果

1宮頸癌、CIN及正常宮頸組織中APOBEC3A蛋白的表達

APOBEC3A定位在胞核和部分細胞質。免疫組化法發現宮頸癌組織、CIN組織和正常宮頸組織中APOBEC3A蛋白陽性表達率分別為46.2%(12/26)、92.6%(25/27)和86.4%(19/22)，3 組差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。宮頸癌組APOBEC3A陽性率顯著低于其余2組，將3組進行兩兩比較，正常宮頸組與宮頸癌組比較差異有統計學意義(P<0.01)，CIN組與宮頸癌組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

Figure 1. Representative images showing APOBEC3A expressions in cervical cancer, CIN and normal cervix (two-step non-biotin method).

圖1宮頸癌、CIN及正常宮頸組織中APOBEC3A的表達

2宮頸癌、CIN及正常宮頸組織中HPV16和HPV18感染的情況

宮頸癌、CIN及正常宮頸組織中HPV16感染陽性率分別為92.3%(24/26)、77.8%(21/27)和54.5% (12/22)，3 組差異有統計學意義(P<0.01)。HPV18感染陽性率分別為80.8%(21/26)、51.8%(14/27)和68.2% (15/22)，各組HPV18感染陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2在宮頸癌、CIN和正常宮頸組織中HPV16和HPV18感染情況以及APOBEC3A蛋白的表達

Table 2. The of HPV16 and HPV18 infection and the APOBEC3A expression in cervical cancer, CIN and normal cervix

**P<0.01vsnormal cervix;##P<0.01vsCIN.

3宮頸組織中APOBEC3A蛋白表達與HPV16或HPV18感染的相關性

統計分析顯示，宮頸癌組、CIN組與正常宮頸組中APOBEC3A蛋白表達與HPV16感染的相關性沒有統計學意義(P>0.05)；APOBEC3A蛋白表達與HPV18感染呈負相關(r=-0.271，P<0.05)，見表3。

表3在宮頸組織中APOBEC3A蛋白表達與HPV16或HPV18感染的關系

Table 3. Relationship of APOBEC3A expression and the infection of HPV16 or HPV18 in cervical tissues

HPVinfectionnAPOBEC3AexpressionrpNegativePositiveHPV18negative252(8．0%)23(92．0%)-0．271<0 05HPV18positive5017(34．0%)33(66．0%)HPV16negative182(11．1%)16(88．9%)-0．181>0．05HPV16positive5717(29．8%)40(70．2%)

4A3A質粒轉染HeLa細胞48h后HPV18E6mRNA的表達

用實時熒光定量PCR檢測A3A質粒轉染HeLa細胞前后HPV18 E6轉錄水平的變化。結果顯示, 不同質量的A3A質粒(1 ng、10 ng、100 ng和1 000 ng)成功轉染HeLa細胞后48 h, 實驗組(A3A1ng、A3A10ng、A3A100ng和A3A1000ng)較對照組(control) HPV18 E6的mRNA表達均降低，但是并不呈現劑量相關性， A3A1000ng組的HPV18 E6 mRNA的表達較對照組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

5A3A質粒轉染HeLa細胞48h后HPV18E6蛋白的表達

Western blotting檢測A3A質粒轉染HeLa細胞48 h后HPV18 E6致癌蛋白和APOBEC3A蛋白表達的變化。實驗組(A3A)轉染A3A質粒1 μg，成功表達APOBEC3A蛋白，HPV18 E6致癌蛋白表達量較對照組(control)和未處理組(untransfected)顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)。而對照組與未處理組細胞間蛋白表達無顯著差異，見圖3。

Figure 2. Effect of A3A plasimid transfection on mRNA expression of HPV18 E6 in HeLa cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2A3A質粒轉染對HeLa細胞HPV18E6mRNA表達的影響

Figure 3. Effect of APOBEC3A overexpression on protein expression of HPV18 E6 in HeLa cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected.

圖3A3A質粒轉染HeLa細胞48h后APOBEC3A和HPV18E6蛋白水平的表達

討 論

APOBEC 家族是近年來報道對多種病毒具有抑制活性的天然免疫分子，屬于胞嘧啶脫氨酶家族。APOBEC 家族抗病毒功能可以通過至少 3 種途徑發揮作用：DNA 編輯、RNA 編輯以及非編輯途徑[11]。APOBEC 家族成員利用其胞苷脫氨酶活性，通過 DNA/RNA 編輯途徑，一方面可通過尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase,UNG)識別并去除尿嘧啶堿基 (U)[12]，在負鏈上發生堿基缺失，最終發生降解；另一方面或可使病毒基因組正鏈上產生大量G到A高突變[13]，最終產生終止密碼子或無功能蛋白。

APOBEC 家族成員還可誘導病毒基因組超突變，為病毒的進化提供了促進因素，病毒基因組序列的變化會改變其表型，如逃避免疫識別獲得抗藥性、提高宿主適應能力、擴展宿主感染范圍等等，與病毒的致病性、流行性及其進化都有著重要而緊密的聯系[11-14]，如具有對Oseltamivir抗藥性的流感病毒，是基于其基因組上發生了單個C到 U 的突變[15-16]，而C到 U 的超突變效應，可以由 APOBEC 或其它胞嘧啶脫氨酶家族成員的作用而實現。因此，APOBEC 蛋白在抑制病毒的同時，又促進了病毒的進化。

APOBEC3A是APOBEC家族中較新的成員之一，其基因位于人類 22 號染色體上, 全長13.24 kb, mRNA 全長1 390 bp, 其編碼框為600 bp, 編碼181個氨基酸。研究表明APOBEC3A具有編輯部分HPV基因組的作用[7]，使HPV基因組突變頻率增加。

關于APOBEC3A在宮頸癌組織中的表達鮮少見于報道。本研究通過免疫組化方法檢測宮頸癌、CIN和正常宮頸組織中APOBEC3A蛋白的表達，結果顯示宮頸癌組APOBEC3A陽性表達較正常宮頸組及CIN組明顯下降，差異有統計學意義。此外，本研究結果顯示在宮頸癌中APOBEC3A以陰性表達53.85%(14/26)和弱陽性表達30.77%(8/26)為主，表達水平顯著低于正常宮頸及CIN組織，提示宮頸癌組織中存在APOBEC3A表達缺失和下調。在宮頸癌組織中HPV16以及HPV18感染率明顯增高，分別為92.3%、80.8%。我們發現在2種高危型HPV16、HPV18感染中，宮頸組織中APOBEC3A蛋白的表達與HPV18感染呈負相關，即在APOBEC3A蛋白低表達時HPV18感染率增高，而在APOBEC3A蛋白高表達時HPV18感染率下降，提示APOBEC3A可能存在抑制高危型HPV18的作用。為了進一步明確APOBEC3A對抗HPV18感染的作用，我們以APOBEC3A質粒轉染HPV18陽性表達的人宮頸癌HeLa細胞株，選取 HPV18 E6作為靶點，探討APOBEC3A對宮頸癌細胞株HPV18 E6致癌基因表達的影響。在成功表達APOBEC3A的實驗組中，HPV 18 E6 mRNA的表達較轉染空質粒的對照組均有明顯下降； HPV 18 E6蛋白的表達較對照組以及未處理組均明顯下降。

綜上所述，在宮頸癌組、CIN組與正常宮頸組中內源性APOBEC3A蛋白的高表達伴隨高危型HPV18的感染率降低，增加宮頸細胞APOBEC3A的表達可以抑制HPV18 E6的轉錄以及表達。在APOBEC3A高表達的宮頸細胞可以產生較好的對抗高危型HPV18感染并抑制E6致癌基因的作用，在阻止感染高危型HPV的宮頸細胞發展成為宮頸癌的過程中起到一定的作用。APOBEC3A低表達的宮頸細胞感染高危型HPV，可能難以產生較好的清除HPV的作用，容易發展成為HPV的持續性感染，發生宮頸細胞癌變的機會明顯增加。內源性APOBEC3A在宮頸癌組織中表達的顯著下降可能參與了宮頸癌的發生和發展。

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CorrelationofhumanAPOBEC3Aproteinexpressionwithhigh-riskHPVinfectionincervicalcancertissues

CHEN Shan1, DI Na2, QIN Jun-pu1, ZHENG Ting-ting1, LI Dan1, ZHOU Li1, ZHANG Di-kai1

(1DepartmentofObstetrics&Gynecology,TheSixthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;2DepartmentofObstetrics&Gynecology,TheSecondAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:diopen@21cn.com)

AIM: To study the effects of human apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide-like protein 3A (APOBEC3A) on high-risk human papillomavirus (HPV) in cervical cancer tissues.METHODSImmunohistochemistry technique was used to detect the expression of human APOBEC3A protein, and Hybribio HPV GenoArray diagnostic kit was used to measure high-risk HPV16 and HPV18 in the specimens from 26 cases of cervical cancer, 27 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) I～III and 22 cases of normal cervix. The APOBEC3A plasmid was transfected into HeLa cells by Lipofectamine. The expression of HPV18 E6 at mRNA and protein levels was examined by RT-qPCR and Western blotting.RESULTSThe protein expression of APOBEC3A in cervical cancer, CIN and normal cervix was 46.2%, 92.6% and 86.4%, respectively. The protein expression of APOBEC3A in cervical cancer was significantly decreased compared with that in normal cervix (P<0.01). The infection rates of HPV16 in cervical cancer, CIN and normal cervix were 92.3%, 77.8% and 54.5%, respectively, and those of HPV18 were 80.8%, 51.8%, 68.2%, respectively. The protein expression of APOBEC3A was negatively correlated with the infection of HPV18 in cervical tissues (P<0.05). Compared with control group, the expression of HPV18 E6 at mRNA and protein levels was decreased after APOBEC3A plasmid was transfected into HeLa cells.CONCLUSIONIn cervical cancer, the high expression of APOBEC3A protein may fight against HPV18 infection, and APOBEC3A inhibits HPV18 E6 transcription and expression.

Apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide-like protein 3A; Human papillomavirus; Uterine cervical neoplasms

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.013

1000- 4718(2013)05- 0845- 05

2013- 02- 05

2013- 04- 16

廣東省人口計生委基金資助項目(No.2009230)

△通訊作者 Tel: 020-38254117; E-mail: diopen@21cn.com