非小細胞肺癌患者腫瘤組織和血清表皮生長因子受體第19、21外顯子的檢測及其臨床特征的分析*

鄒 敏， 周韶璋， 于起濤， 曾愛屏， 宋向群△

(廣西醫科大學 1附屬腫瘤醫院化療二科， 2研究生院，廣西 南寧 530021)

非小細胞肺癌患者腫瘤組織和血清表皮生長因子受體第19、21外顯子的檢測及其臨床特征的分析*

鄒 敏1,2， 周韶璋1， 于起濤1， 曾愛屏1， 宋向群1△

(廣西醫科大學1附屬腫瘤醫院化療二科，2研究生院，廣西 南寧 530021)

目的檢測非小細胞肺癌 (non-small-cell lung cancer， NSCLC)患者血清與腫瘤組織中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的突變狀態，分析兩者的一致率及其臨床特征，比較2種方法的優劣，探索血清代替組織檢測的可行性。方法收集中國人群NSCLC患者腫瘤組織和匹配的血清標本共90對，腫瘤組織和血清均用蝎型探針擴增阻滯突變系統(scorpions amplification refractory mutation system，SARMS)和直接測序2種方法檢測EGFR基因中第19和21外顯子的突變狀態，應用2檢驗和Fisher精確檢驗分析19和21外顯子EGFR突變與患者臨床特征的關系，分析在血清和腫瘤組織標本中基因突變的一致性及2種檢測方法的靈敏度和特異度。結果SARMS法檢測腫瘤組織和血清標本EGFR突變的檢出率分別是46.7% (42/90)和18.9%(17/90)，腫瘤組織和血清的突變陽性一致率為16.7%(15/90)；而直接測序法檢測腫瘤組織和血清標本EGFR突變的檢出率分別是30%(27/90)和4.4%(4/90)，兩者的突變陽性一致率4.4%(4/90)。與測序法相比，SARMS法的靈敏度是35.8%。此外，腫瘤組織的EGFR突變與性別、吸煙史和病理類型有關(P<0.05)，血清EGFR突變與年齡、性別、病理類型和臨床分期無明顯相關(P>0.05)。結論血清的突變檢出率仍較組織低，但SARMS法的靈敏度較直接測序法高，腫瘤組織仍為目前確定NSCLC患者EGFR基因突變狀態的主要來源和依據。

肺腫瘤; 受體，表皮生長因子; 外顯子

肺癌是我國常見惡性腫瘤譜中的主要腫瘤之一，其發生率和死亡率近年來迅速增加，目前已發展成為我國癌癥死亡率的首位，對于晚期的非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)已成為重要的治療方法，目前大量研究顯示：NSCLC患者表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)突變均發生在酪氨酸激酶域ATP結合域附近(第18～21外顯子)，表現為1個或1段堿基的缺失、插入以及堿基替換引起的錯義突變，這些突變可以引起酪氨酸激酶的活性增強[1]。EGFR基因第19和21外顯子突變為活化性突變，第18和20外顯子突變為耐藥性突變，約90%突變集中在第19和21外顯子[2]。張靜等[3]研究表明第19外顯子多個核苷酸框架缺失突變，位于EGFR-TKIs活化部位，都包含共同的堿基序列缺失(第747～750密碼子，以下簡稱19del)，分別編碼亮氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸(leucine，arginine， glutamic acid and alanine,LREA)，第21外顯子點突變位使858位上的亮氨酸被精氨酸替代(以下簡稱L858R)。對于最初EGFR基因突變的人群， EGFR-TKIs作為一線藥物的客觀緩解率為70.0%，均高于一線化療的客觀有效率29.0%～47.3%[ 4]，這提示EGFR基因突變腫瘤對靶向治療更為敏感。EGFR突變是EGFR-TKIs療效強有力的預測因子[ 4]，但是有部分晚期肺癌患者由于腫瘤生長部位取材困難或就診時體能狀態較差，有時難于獲得足夠的腫瘤組織用于病理診斷和基因檢測。EGFR突變基因具有腫瘤異質性的體細胞遺傳性，因而血液游離DNA中就有可能檢測到相同的遺傳改變。Kimura等[5]采用直接測序法對晚期12例NSCLC患者行外周血和腫瘤組織配對樣本突變檢測，結果顯示外周血與腫瘤組織突變檢測一致率為58%，血清的靈敏度為66%和特異度為63%，隨后各國學者采用多種方法進行這方面研究[6-9]，結論尚無法一致，本研究采用直接測序法和蝎型探針擴增阻滯突變系統(scorpions amplification refractory mutation system， SARMS)2種方法檢測中國人群NSCLC腫瘤組織和血清EGFR基因的活化性突變狀態，了解EGFR基因在腫瘤組織和血清的一致率，比較直接測序和SARMS法的優劣，對血清能否代替腫瘤組織的可能性進行探討。

材 料 和 方 法

1研究對象

收集90例2009年1月至2012年10月期間就診于廣西醫科大學附屬腫瘤醫院的非小細胞肺癌患者的血清和組織標本，患者入選標準包括：(1)病理學證實為非小細胞肺癌的患者；(2)所有的患者均未接受過靶向治療和新輔助化療；(3)確保所獲得的標本能滿足檢測需要;(4)取材均符合倫理要求。腫瘤組織標本經過手術切除后立即浸泡于液氮中，隨后保存于-80 ℃冰箱中，相匹配的血清標本均在手術前或獲取組織標本前抽取全血后離心保存在-80 ℃的冰箱中。入選的患者均收集其以下信息：年齡、性別、吸煙史、組織病理類型及臨床分期。病人的組織病理分型參考2004版世界衛生組織(World Health Organization,WHO)的肺癌組織學分類[10]，臨床分期參考第6版國際肺癌研究協會(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)的肺癌TNM分期。

2主要試劑

DNA提取試劑盒(DNA Mini Kit 51304)為Qiagen產品，直接測序所用引物[11](引物序列見表1)和Mix均由寶生物工程(大連)有限公司根據要求合成。DxS EGFR29 Mutation Kit, ABI 3730XL,Lightcycler 480,PCR 8聯反應條輔助器(BIOplastics,Cat:B-79480)。

表1 EGFR基因外顯子19和21 PCR擴增引物序列

3主要方法

3.1DNA提取 所有的標本均用DNA提取試劑盒提取，具體提取步驟按試劑盒說明書進行。提取的DNA均經過超微量分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop 2000)檢測，儲存在-20 ℃冰箱中。

3.2PCR擴增和直接測序 PCR總的反應體系為50 μL，Mix 25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,DNA模板2 μL，去離子水19 μL，擴增條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共35個循環，72 ℃ 2 min。同時PCR反應設置內參照為GAPDH，其PCR反應引物見表1，內參照擴增條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 45 s，共35個循環，72 ℃ 3 min。取PCR產物5 μL，在3%瓊脂糖凝膠上電泳，后采用凝膠圖像分析系統(Gel-Pro Analyzer 3.0)分析目的基因，見圖1。對于顯示目的基因的PCR產物送北京諾賽基因組研究中心有限公司直接測序(測序用儀器ABI 3730XL)，測序的序列和GenBank中人類EGFR基因(AY588246)比對，見圖2。

Figure 1. The PCR results of exons 19 and 21.M: marker (100 bp ladder)；19: exon 19(290 bp);21:exon 21(302 bp)

圖1PCR產物電泳圖

Figure 2. Base sequencing figures of the positive samples.

圖2陽性標本的堿基測序圖

3.3SARMS檢測E746-A750del和L858R 按DxS EGFR29 Mutation Kit操作，根據文獻[8]設置檢測反應，反應體系為20 μL,其中DNA樣品0.4 μL，去離子水3.6 μL,其它反應試劑16 μL。然后再進行RT-PCR擴增，RT-PCR的循環參數：第一階段95 ℃ 10 min，1個循環；第二階段95 ℃ 30 s，61.0 ℃ 1 min，40個循環，樣品測試結果判讀標準：參照試劑盒內容，陽性為Ct標本-Ct對照

4統計學處理

結 果

1研究對象臨床特征

共90例患者，年齡<59歲占47.8%(43/90)，≥59歲占52.2%(47/90)，男性占61.1%(55/90)，女性占38.9%(35/90)，不吸煙占65.6%(59/90)，吸煙占34.4%(31/90)，腺癌占63.3%(57/90)，非腺癌占36.7%(33/90)，Ⅰ+Ⅱ期占37.8%(34/90)，Ⅲ+Ⅳ期占62.2%(56/90)。

2NSCLC患者血清與腫瘤組織中EGFR基因19和21外顯子突變狀態及臨床特征

采用直接測序法檢測90例非小細胞肺癌患者的腫瘤組織和血清標本，腫瘤組織總共檢測出27例EGFR基因突變，其中15例(55.56%)為19-del缺失，12例(44.44%)為L858R點突變，總突變檢測率為30.0%(27/90)；血清共檢測出4例EGFR突變， 4例均為L858R點突變，總突變檢測率為4.4%(4/90)。采用SARMS方法檢測，腫瘤組織總共檢測出42例EGFR基因突變，其中23例(54.76%)為19-del缺失，19例(45.23%)為L858R點突變，總突變檢出率為46.7%(42/90)；90例血清樣本中， 共檢測出17例，其中9例(52.94%)為19-del缺失，8例(47.05%)為L858R點突變，總突變檢測率18.9%(17/90)。2種方法均未發現19-del缺失和L858R點突變共存現象。統計分析顯示，非小細胞肺癌組織EGFR突變陽性和陰性患者在年齡和臨床分期均無統計學差異(P>0.05)，在性別、吸煙史和病理類型均有統計學差異(P<0.05)，而血清EGFR突變陽性和陰性患者在年齡、性別、病理類型、吸煙史和臨床分期均無統計學差異(P>0.05)，見表2、3。

表2 患者腫瘤組織和血清病理特征和臨床特征的比較(直接測序法)

T-19：tumor tissue 19-del;T-21：tumor tissue L858R;Any-T：tumor tissue detection;P-19：serum 19-del;P-21：serum L858R;Any-P：serum detection.

表3 患者腫瘤組織和血清病理特征和臨床特征的比較(SARMS法)

T-19：tumor tissue 19-del;T-21：tumor tissue L858R;Any-T：tumor tissue detection;P-19：serum 19-del;P-21：serum L858R;Any-P：serum detection.

3EGFR活化性突變的陽性一致率及血清活化性突變的靈敏度、特異度、陽性預測價值和陰性測價值

SARMS法和直接測序法檢測血清EGFR活化性突變的靈敏度分別為35.8%(15/42)和14.8%(4/27)，特異度分別為95.9%(46/48)和100%(63/63)，陽性預測價值分別為88.2%(15/17)和100%(4/4)，陰性預測價值分別為73.0%(46/63)和73.2%(63/86)。腫瘤組織EGFR活化性突變的一致率為83.3%(75/90)。2種方法檢測90例患者血清和腫瘤組織EGFR活化性突變的一致率分別為16.7%(15/90)和4.4%(4/90)，見表4、5。

表4SARMS法檢測血清和腫瘤組織中EGFR活化性突變的一致率

Table 4. The concordance rate of detecting the activated mutations ofEGFRin serum and tumor by SARMS

TumortissueSerumTotalMutationNon?mutationMutation152742Non?mutation24648Total176390

Sensitivity (%)=(both tumor and serum mutation)/(total tumor mutation)×100%；specificity (%)=(both tumor and serum non-mutation)/(total tumor non-mutation)×100%；positive predictive value (%)=(both tumor and serum mutation)/(total serum mutation)×100%；negative predictive value (%)=(both tumor and serum non-mutation)/(total serum non-mutation)×100%；concordance (%)=(both serum and tumor mutation)/(total cases)×100%.

表5直接測序法檢測血清和腫瘤組織中EGFR活化性突變的一致率

Table 5. The concordance rate of detecting the activated mutations ofEGFRin serum and tumor by direct sequencing

Sensitivity (%)=(both tumor and serum mutation)/(total tumor mutation)×100%；specificity (%)=(both tumor and serum non-mutation)/(total tumor non-mutation)×100%；positive predictive value (%)=(both tumor and serum mutation)/(total serum mutation)×100%；negative predictive value (%)=(both tumor and serum non-mutation)/(total serum non-mutation)×100%；concordance (%)=(both serum and tumor mutation)/(total cases)×100%.

討 論

目前，越來越多的靶向藥物被用于NSCLC的治療。林小梅等[12]研究了針對新型融合基因EML4-ALK的靶向藥物。該融合基因由棘皮動物微管相關蛋白樣4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4，EML4)和間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)兩者的部分基因相互融合而成。中國人群EML4-ALK融合基因的突變率7.8%，因而針對該融合基因的靶向藥物獲益率較低。而Tony等[4]對1 217名ⅢB或Ⅳ期不吸煙或少吸煙的未接受過任何抗腫瘤治療的肺腺癌患者行EGFR基因檢測發現，EGFR突變占35.9%，其中19-del占53.6%，L858R占42.3%，T790M占4.2%，其它突變占3.8%；對EGFR活化性突變的患者使用一線藥物吉非替尼獲益率高，不僅明顯延長無進展生存期(progression-free survival, PFS)，而且提高了患者的生活質量，提高了客觀緩解率，減少了毒副反應。Zhou等[2]對165名ⅢB或Ⅳ期且明確診斷EGFR基因第19或21外顯子突變的NSCLC患者分別行一線藥物化療和EGFR-TKI(厄洛替尼)治療，中位PFS分別是4.6個月和13.1個月，因此對NSCLC患者行EGFR基因第19和21外顯子突變的檢測對治療有重大的意義。

EGFR基因檢測標本的來源常見的有手術切除標本、纖維支氣管鏡下所取得的組織、外周轉移的淋巴結活檢等，但臨床上有部分患者就診時已失去手術機會，纖維支氣管鏡獲取的標本較少，組織檢測EGFR較困難， 對這部分患者進行EGFR檢測是當前臨床實踐中較為棘手的問題。有研究[13]表明肺癌組織血供豐富，腫瘤患者血清中存在大量的游離DNA，其含量約為健康人的10倍以上，血清游離DNA主要來自凋亡壞死的癌細胞，其遺傳特異性與腫瘤基因組DNA相同。Bai等[6]對晚期230例NSCLC患者行外周血和腫瘤組織配對樣本突變檢測，結果顯示外周血與腫瘤組織突變檢測一致率為87%，血清的靈敏度為82%和特異度為90%，進一步證實了血清循環DNA與腫瘤組織DNA的EGFR基因突變一致，因而以血清游離DNA為靶分子探討療效及預后分子的標志物成為目前研究的熱點。

本研究中90例晚期NSCLC患者血清和腫瘤組織配對樣本采用SARMS和直接測序2種方法行活化性感突變檢測，陽性一致率分別是16.7%和4.4%，血清靈敏度分別是35.8%和14.8%，特異度分別是95.9%和100%，陰性預測值分別為73.0%(46/63)和73.2%(63/86)。這與Goto等[7]采用SARMS法對86例晚期NSCLC患者行外周血和腫瘤組織配對樣本突變檢測，外周血與腫瘤組織突變檢測一致率為66%，血清的靈敏度為43%和特異度為100%是一致的，但本研究中陰性預測值73.0%高于Goto等[7]研究報道的陰性預測值54.7%，可能與本研究中入選NSCLC患者包含Ⅰ～Ⅳ期，而Goto等[7]選擇晚期NSCLC患者有關，此外本研究對血漿DNA樣本EGFR活化性突變檢出的效率與Qin等[14]報道SARMS法靈敏度高于直接測序是一致的。因此對于同一組標本行EGFR活化性突變檢測，SARMS陽性一致率和靈敏度均高于直接測序法，這可能是直接測序法只能檢測大于30%突變拷貝數[15]，而SARMS法采用的EGFR活化性突變檢測試劑盒結合了ARMSTM和Scorpions 2種技術，檢測起來方便、快捷、靈敏度和特異度高，可以檢測約1%的拷貝數[9]。

本研究中，SARMS和直接測序法的活化性突變一致率分別是16.7%和4.4%，均低于Bai等[6]的研究，不僅可能和Bai等[6]的研究采用變性高效液相色譜法可以檢測3%的突變拷貝有關系，而且可能與腫瘤組織釋放至外周血游離DNA水平未達到檢測水平或者腫瘤的異質性有關，還可能和血清中含有來自正常細胞的DNA有關。

目前腫瘤組織EGFR突變陽性多見于不吸煙、腺癌的非小細胞人群[4]。在本研究中比較血清EGFR基因19和21外顯子陽性和陰性病人的臨床及病理特征顯示，陽性和陰性的病人在性別、年齡、吸煙史、病理類型和臨床分期方面差別均無統計學意義，但入選本研究的患者是未經過篩選的非小細胞肺癌人群，2種方法檢測均為EGFR活化性突變血清共4例，病人臨床特征表現為：3例低于59歲，4例為不吸煙人群，3例為腺癌病人，1例為腺鱗癌病人，亦含有腺癌成分，這與Bai等[6]等研究結果是一樣的，說明血清EGFR活化性突變可能多見于小于60歲、無吸煙史和腺癌患者，但由于陽性患者的樣本量偏少，需要今后大樣本的數據去驗證。

綜上所述，我們采用了SARMS和直接測序法分析了NSCLC患者EGFR基因19和21外顯子的突變狀態，相對于直接測序，SARMS有較高的靈敏度，更適于對腫瘤組織和血清EGFR活化性突變狀態的檢測，對于EGFR活化性突變狀態，2種檢測方法，腫瘤組織和血清有較好的總體一致率，但血清EGFR活化性突變的陽性檢出率仍較低，且靈敏度和特異度也較腫瘤組織低，組織檢測仍為目前確定患者EGFR基因突變狀態的主要來源和依據。在無法獲取腫瘤組織的情況下，對血清行EGFR敏感突變檢測，SARMS相對于直接測序有較好的靈敏度，但用SARMS方法檢測，血清能否替代腫瘤組織，仍然需要大樣本、多中心、盲法研究進一步的證實。

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Determinationofmutationsinexons19and21ofepidermalgrowthfactorreceptorintumortissueandserumsamplesfromChinesepatientswithnon-small-celllungcancer

ZOU Min1,2, ZHOU Shao-zhang1, YU Qi-tao1, ZENG Ai-ping1, SONG Xiang-qun1

(1TheSecondDepartmentofChemotherapy,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,2PostgraduateCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:xiangquns@qq.163.com)

AIM: To detect the mutations in exons 19 (deletion) and 21 (L858R) of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene in serum and matched tumor samples from the patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) and to investigate the concordance rate between the sample sources.METHODSDNA from serum and matched tumor samples from 90 patients with NSCLC was extracted for detecting the mutations in exons 19 and 21 ofEGFRgene by direct DNA sequencing and scorpion amplification refractory mutation system (SARMS). The relationship betweenEGFRmutations and clinical features, and the concordance between the sample sources were analyzed by2-test and Fisher’s exact test. The sensitivity and specificity of the 2 methods were compared.RESULTSIn 90 patients, the mutations in exons 19 and 21 ofEGFRgene were detected in 17 serum samples and 42 tumor tissues by SARMS with the detection rates of 18.9% and 46.7%, respectively. Positive consistence rate between serum DNA and tumor DNA was 16.7%. Meanwhile,the mutations were only found in 4 serum samples (4.4%) and 27 tumor tissue samples (30%) by direct DNA sequencing, with the sex, positive consistence rate of 4.4%. Compared with direct sequencing, the sensitivity of SARMS was 35.8%. In addition, the mutations in exons 19 and 21 ofEGFRgene in the tumor tissues were correlated with sex, pathological type and smoking status (P<0.05), and the mutations in the serum were not associated with age, sex, pathological type, smoking status and clinical stage (P>0.05).CONCLUSIONThe detection rate of the mutations in exons 19 and 21 ofEGFRgene in serum samples is lower than that in tissue samples. The sensitivity of SARMS is higher than that of direct DNA sequencing. Tumor tissues are still the main source for detectingEGFRgene mutations in the patients with NSCLC.

Lung neoplasms; Receptors,epidermal growth factor; Exons

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.012

1000- 4718(2013)05- 0839- 06

2013- 02- 01

2013- 03- 26

廣西壯族自治區衛生廳重點學科資助項目(No.200968)

△通訊作者 Tel： 0771-5334955; E-mail： xiangquns@qq.163.com