藤黃酸對彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1增殖和凋亡的影響及其分子學機制*

師憲平， 藍曉瑩， 陳 鑫， 王文文， 溫創宇， 黃美近， 劉煥亮△

(1廣州醫學院免疫研究所，廣東 廣州 510182； 2中山大學附屬第三醫院血液內科，廣東 廣州 510630;中山大學 3胃腸病學研究所， 4附屬第六醫院，廣東 廣州 510655)

藤黃酸對彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1增殖和凋亡的影響及其分子學機制*

師憲平1△， 藍曉瑩1， 陳 鑫1， 王文文2， 溫創宇3,4， 黃美近4， 劉煥亮3,4△

(1廣州醫學院免疫研究所，廣東 廣州 510182；2中山大學附屬第三醫院血液內科，廣東 廣州 510630;中山大學3胃腸病學研究所，4附屬第六醫院，廣東 廣州 510655)

目的探討藤黃酸對彌漫性大B淋巴瘤細胞增殖與凋亡的影響及其分子學機制，研究藤黃酸治療彌漫性大B細胞淋巴瘤的潛在應用價值。方法用藤黃酸處理細胞，采用MTS法對淋巴瘤細胞進行細胞活力及增殖抑制測定；碘化丙啶(PI)單染熒光顯微鏡觀察細胞形態改變；采用AnnexinⅤ-FTIC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡；利用Western blotting檢測蛋白酶體系統相關蛋白(Ubs、Bax、HSP90和IκB-α)、凋亡相關蛋白(PARP、pro-caspase-3和caspase-8)及細胞增殖信號通路相關蛋白(ERK和STAT5)的變化情況。結果藤黃酸明顯抑制OCI-LY-1細胞的增殖活性，誘導OCI-LY-1細胞呈凋亡趨勢；隨藤黃酸濃度升高，Ubs、Bax和HSP90表達升高；隨藤黃酸濃度升高與作用時間延長，PARP切割、pro-caspase-3、pro-caspase-8、ERK、p-ERK、STAT5及p-STAT5表達下降。結論藤黃酸抑制彌漫性大B淋巴瘤細胞株的蛋白酶體活性，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

彌漫性大B淋巴瘤； 藤黃酸； 蛋白酶體； 細胞增殖； 細胞凋亡

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma, NHL)是目前發病率增長最快的淋巴瘤，其中彌漫性大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是最常見的NHL。DLBCL是大B型淋巴細胞彌漫性惡性增生性疾病，在最近的10～20年間發病率逐漸增加。DLBCL在西方國家占成人非霍奇金淋巴瘤30%～40%，在發展中國家高達60%。目前R-CHOP(美羅華，聯合環磷酰胺，阿霉素度，長春新堿，強的松)被國際上公認為治療侵襲性NHL的經典療法，在治療低度惡性NHL取得了良好的效果，然而在用藥過程中產生了極大的耐藥復發問題及并發癥(支氣管痙攣、心律失常、肝功能衰竭、低血藥呼吸困難等)，嚴重影響了治療效果，迫切需要篩選出作用機制各異的活性化合物能夠有效治療NHL。

臨床實驗表明，蛋白酶體抑制劑對難治性和復發性淋巴造血系統惡性腫瘤有較好的療效。蛋白酶體抑制劑是一種新型抗腫瘤藥物，具有抑制腫瘤細胞生長，促進細胞凋亡，干擾細胞周期進程，提高腫瘤細胞對化療和放療的敏感性等作用。目前，已開發出多種蛋白酶體抑制劑，包括肽基醛類MG132、二肽硼酸類PS-341(bortezomib/velcade)等[1-2]，均可抑制26S蛋白酶體活性，調節泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system, Ups)功能。已有文獻報道，PS-341聯合化療藥物可提高某些不同亞型彌漫性大B細胞淋巴瘤對藥物的反應[3]。

藤黃酸(gambogic acid，GA)是中藥藤黃的主要活性成份，大量研究表明藤黃酸是一種多靶點的抗腫瘤藥物，其在胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、神經膠質瘤等實體腫瘤和血液系統惡性腫瘤中表現出強大的抗癌活性[4]。已有文獻報道，藤黃酸與其它蛋白酶體抑制劑具有協同抑制蛋白酶體活性的作用[5]。研究表明，NK/T細胞淋巴瘤及NK/T淋巴瘤株HANK1細胞強表達泛素活化酶E1(ubiquitin activating enzyme 1, UBE1)[6]，提示Ups功能亢進可能與NK/T細胞淋巴瘤的發生和發展有關。為此，我們對其它亞型的淋巴瘤細胞進行篩選，發現藤黃酸對彌漫性大B細胞淋巴瘤OCI-LY-1細胞的蛋白酶體活性有明顯的抑制作用。本研究以彌漫性大B細胞淋巴瘤OCI-LY-1細胞株為研究模型，探討藤黃酸對其Ups系統的調控作用，檢測藤黃酸對細胞增殖和凋亡通路的影響，進而探討藤黃酸治療彌漫性大B細胞淋巴瘤的潛在應用價值。

材 料 和 方 法

1材料

彌漫性大B細胞淋巴瘤OCI-LY-1細胞由本實驗室保存。RPMI-1640高糖培養基和胎牛血清Gibco。藤黃酸、MTS、碘化丙啶和細胞凋亡雙染檢測試劑盒，Tween-20與DMSO購自Sigma-Aldrich，抗pro-caspase-8、pro-caspase-3、p-ERK、ERK、Bax、熱休克蛋白90(heat-shock protein 90,HSP90)及IκB-α為Cell Signaling產品，抗PRAP為BD產品，抗XIAP、Mcl-1、ubiquitin proteins(Ubs)抗體購自Santa Cruz，抗GAPDH、p-STAT5和STAT5抗體購自Upstate Technology，HRP-抗鼠/兔Ig抗體為Pierce Biotechnology產品。

2主要方法

2.1細胞培養 OCI-LY-1細胞用RPMI-1640(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，實驗所用的細胞均處于對數生長期。

2.2細胞活力檢測實驗 用MTS法測細胞活力抑制情況，設空白對照組、對照組和實驗組；取對數生長期的OCI-LY-1細胞接種于96孔板，對照組和實驗組每孔接種50 μL細胞懸液，共15 000個細胞，空白對照組加入100 μL不含細胞培養基，實驗組每孔再加入50 μL含藤黃酸培養基，使加入終濃度為0.16、0.3125、0.625、1.25、2.5及5.0 μmol/L，對照組加入50 μL含血清的培養基，空白對照組不加，每組3個重復孔。不同劑量的藤黃酸作用44 h后于實驗各孔分別加MTS試劑20 μL，37 ℃繼續孵育4 h，于酶聯免疫檢測儀490 nm測定各孔的吸光度(A)，細胞活力(%)=(A實驗組-A空白對照組)/(A對照組-A空白對照組)，以濃度為橫坐標，細胞活力為縱坐標繪制藤黃酸對OCI-LY-1細胞生長活力抑制率柱狀圖。

2.3PI單染法觀察細胞學形態 取對數生長期細胞接種于24孔板，每孔接種1 mL細胞懸液，共2×105細胞，實驗組加入終濃度為0.25、0.5及0.75 μmol/L藤黃酸，對照組不加藥，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養，5 h后加入已過濾的PI染液(1∶100)，在加藥24 h后顯微鏡TRITC熒光通道拍照記錄PI陽性細胞。當已死亡或瀕臨死亡的細胞膜完整性被破壞時，PI可以進入細胞核內與DNA雙鏈結合，受激發后發出紅色熒光，此類細胞記為陽性細胞。

2.4Annexin V/PI雙標記法流式細胞術測定細胞凋亡 實驗設有不同藤黃酸濃度處理組。計數細胞，2×108cells/L，收集細胞，1×binding buffer洗滌細胞后，Annexin V工作液100 μL室溫避光孵育15 min，檢測前每管加PI 1 μL上機。在雙染流式細胞計數儀的散點圖上，取右下象限和右上象限的總和(即Annexin V陽性細胞群)計為凋亡細胞。實驗完全按照Sigma-Aldrich公司提供的試劑說明書操作，重復3次。

2.5Western blotting 不同時點和不同濃度的藤黃酸處理OCI-LY-1細胞后收集細胞，加入蛋白裂解液充分裂解細胞提取蛋白，Bio-Rad蛋白濃度試劑盒紫外分光750 nm波長定量蛋白濃度。100～130 V恒壓電泳約90 min，100 V恒壓轉膜約90 min，5%牛奶室溫封閉1 h，特異性Ⅰ抗4℃過夜次日曝光。

3統計學處理

用GraphPad Prism 4.0軟件對數據進行分析,組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1GA對OCI-LY-1細胞活力及細胞形態學的影響

一定濃度的GA對OCI-LY-1細胞的生長有抑制作用，隨著GA濃度增大，細胞出現空泡、破碎等形態學改變，同時細胞增長緩慢，可見大量死亡細胞。GA處理細胞44 h后，當GA劑量達0.08 μmol/L時細胞活力明顯受到抑制(P<0.05)，且GA對OCI-LY-1細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴效應,見圖1，GA對OCI-LY-1細胞生長的半數抑制濃度是0.20 μmol/L。不同劑量的GA處理24 h后對OCI-LY-1細胞具有明顯的誘導死亡作用,見圖2。

Figure 1. Effect of GA on cell viability of OCI-LY-1 cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmo/L.

圖1GA對彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1活力的影響

Figure 2. OCI-LY-1 cell death induced by GA for 24 h.

圖2GA誘導24h后彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1死亡

2GA對OCI-LY-1細胞凋亡的誘導

經不同濃度GA處理24 h后，當GA濃度達0.25 μmol/L時OCI-LY-1細胞凋亡率明顯升高，GA誘導OCI-LY-1細胞凋亡作用呈劑量依賴效應,見圖3，表明GA可以誘導OCI-LY-1細胞發生凋亡。

Figure 3. Apoptosis of OCI-LY-1 cells induced by GA for 24 h.

圖3GA誘導24h后彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1凋亡

3GA抑制OCI-LY-1細胞中泛素蛋白酶體系統的活性

圖4顯示，當GA濃度達0.25 μmol/L時，內源性泛素化蛋白Ubs表達增加(P<0.05)，其底物蛋白HSP90的表達亦出現相應程度的提高(P<0.05)，而當GA濃度達0.5 μmol/L時，Ubs的另一底物蛋白Bax表達也出現增加(P<0.01)，GA誘導這些蛋白的表達增加呈劑量依賴效應。GA不影響Ubs的其中一底物蛋白IκB-α的表達。

Figure 4. The expression of Ubs and the subtracts of OCI-LY-1 cells induced by GA for 6 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖4GA處理6h后上調彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1泛素化蛋白及其底物的表達

4GA對凋亡相關蛋白表達的影響

圖5結果顯示，用不同濃度GA處理細胞24 h，當GA濃度達0.25 μmol/L時，PARP前體減少，出現切割帶，同時引起caspase家族相關蛋白caspase-3及caspase-8前體減少，出現caspase-8切割帶，且呈現GA濃度依賴性(P<0.01)。用0.75 μmol/L GA分別處理細胞6 h、12 h和24 h，于6 h時便出現PARP切割帶，同時caspase-3及caspase-8前體減少，蛋白變化呈現時間依賴性(P<0.01)。

Figure 5. Effects of GA on the expression of apoptosis-related proteins PARP, pro-caspase-3 and pro-caspase-8 in OCI-LY-1 cells.Mean±SD.n= 3.**P<0.01vs0 μmol/L or 0 h.

圖5GA對彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1凋亡相關蛋白PARP、pro-caspase-3和pro-casepase-8表達的影響

5GA對細胞增殖信號通路的影響

圖6顯示，用不同濃度GA處理細胞24 h，當GA濃度達0.25 μmol/L時增殖相關蛋白ERK和STAT5磷酸化形式蛋白表達明顯下降(P<0.01)，而其總蛋白形式也有下降(P<0.05)，且均呈現GA濃度依賴性。用0.75 μmol/L GA分別處理細胞6 h、12 h和24 h，于6 h時出現ERK和STAT5磷酸化形式蛋白表達明顯下降(P<0.01)，而其總蛋白形式也下降(P<0.05)，且均呈現GA時間依賴性。

Figure 6. Effects of GA on the expression of proliferation-related proteins p-ERK, ERK, p-STAT5 and STAT5 in OCI-LY-1 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L or 0 h.

圖6GA對彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1增殖相關蛋白p-ERK、ERK、p-STAT5和STAT5表達的影響

討 論

隨著對腫瘤調控機制的深入研究，腫瘤治療分子靶點的尋找已成為當今的發展方向[7]。近年發現，許多腫瘤和遺傳性疾病的發生都與泛素蛋白酶體功能失調有關[8-10]。蛋白酶體抑制劑通過抑制腫瘤細胞內蛋白酶體活性來調節細胞周期，促進細胞凋亡。蛋白酶體抑制劑通過改變蛋白酶體的酶切位點抑制蛋白酶體活性，目前已成為免疫學、炎癥及腫瘤學等領域的研究熱點。已有不少文獻報道，蛋白酶體抑制劑對惡性腫瘤具有治療效果[11]。現已證實小分子蛋白酶體抑制劑PS-341對某些惡性血液系統疾病病具有良好的治療效果，其中包括多發性骨髓瘤和淋巴瘤[12]。同時，蛋白酶體抑制劑對套細胞淋巴瘤的治療亦有相當意義，盡管臨床上作為化療藥物的使用仍未成功[13]。本文選取了彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-1為研究對象，探討小分子化合物GA誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖及其相關分子學機制。實驗結果表明，GA能夠誘導細胞凋亡，這可能與抑制細胞蛋白酶體系統的活性，誘導PARP切割，激活cspase-3和caspase-8相關。同時，GA的抑制細胞增殖效果可能是通過抑制JAKs/STATs和MEK/ERK信號轉導通路的活化而產生。

實驗證實GA明顯抑制OCI-LY-1細胞生長并誘導細胞凋亡。MTS法顯示，隨著GA濃度增加，OCI-LY-1細胞的生長抑制率明顯增加；Annexin V/PI雙標記流式細胞術檢測結果顯示GA呈劑量依賴性誘導細胞凋亡；Western blotting檢測顯示內源性泛素化蛋白Ubs及其底物蛋白Bax、HSP90呈不同程度的增加；caspase-8與caspase-3前體pro-caspase-8與pro-caspase-3的表達均隨GA濃度和作用時間的增加而減少，PARP也呈劑量與時間依賴性的切割，顯示了caspase級聯通路的活化。上述結果表明，GA能誘導彌漫性大B淋巴瘤細胞的凋亡，其可能機制是抑制了細胞蛋白酶體活性，使某些促凋亡蛋白例如Bax的表達水平增加，同時活化了caspase級聯反應。JAKs/STATs和MEK/ERK信號轉導通路與細胞的增殖、分化及凋亡關系密切，這些通路異常活化可導致細胞異常增殖和惡性轉化[14]，我們的結果顯示，ERK和STAT5總體及磷酸化形式的蛋白表達水平均下調，提示了這些信號通路的活化受到GA的抑制，進而導致細胞增殖抑制。蛋白酶體系統的活性抑制如何激活caspase級聯通路以及蛋白酶體系統的活性是否直接調控細胞增殖通路，是我們需要進一步探索的科學問題。

總之，GA可能通過調控蛋白酶體系統活性，下調凋亡相關蛋白表達及JAKs/STATs和MEK/ERK信號轉導通路，從而明顯抑制彌漫性大B淋巴瘤OCI-LY-1細胞生長，誘導其凋亡，對彌漫性大B淋巴瘤具有重要的治療前景。

[1] Goy A, Younes A, Mclaughlin P, et al. Phase II study of proteasome inhibitor bortezomib in relapsed or refractory B-cell non-Hodgkin’s lymphoma[J]. J Clin Oncol,2005,23(4):667-675.

[2] 張志剛，莫祥蘭，蘇祖蘭，等. 蛋白酶體抑制劑MG132對NK/T淋巴瘤細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響[J]. 中國病理生理雜志,2009，25(12):2362-2365.

[3] Koprivnikar JL, Cheson BD. Bortezomib: a proteasome inhibitor with an evolving role in select subtypes of B-cell non-Hodgkin’s lymphoma[J]. Future Oncol,2012,8(4):359-371.

[4] Yang LJ, Chen Y, He J, et al. Effects of gambogic acid on the activation of caspase-3 and downregulation of SIRT1 in RPMI-8226 multiple myeloma cells via the accumulation of ROS[J]. Oncol Lett,2012,3(5):1159-1165.

[5] Huang H, Chen D, Li S, et al. Gambogic acid enhances proteasome inhibitor-induced anticancer activity[J]. Cancer Lett,2011,301(2):221-228.

[6] Su ZL, Mo XL, Feng ZY, et al.UBE1 expression in extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type[J]. Leuk Lymphoma,2008,49(9):1821-1822.

[7] Weinstein IB, Begemann M, Zhou P, et al. Disorders in cell circuitry associated with multistage carcinogenesis: exploitable targets for cancer prevention and therapy[J]. Clin Cancer Res,1997,3(12 Pt 2):2696-2702.

[8] Mani A, Gelmann EP. The ubiquitin-proteasome pathway and its role in cancer[J]. J Clin Oncol,2005,23(21):4776-4789.

[9] 蔡同建，陳景元，李 妍，等. 蛋白酶體抑制劑MG132對PC12細胞的增殖抑制作用[J]. 第四軍醫大學學報,2006,27(12):1137-1139.

[10] 張衛國，吳清明，于皆平，等. 阻斷泛素-蛋白酶體通路對食管癌細胞生長及端粒酶活性的影響[J]. 中國病理生理雜志,2004,20(7):1208-1212.

[11] 費正華，姜 藻. 蛋白酶體抑制劑藥理基礎與臨床應用進展[J]. 中華現代內科學雜志,2006,3(11):1244-1246.

[12] Kuhn DJ, Orlowski RZ. The immunoproteasome as a target in hematologic malignancies[J]. Semin Hematol,2012,49(3):258-262.

[13] Holkova B, Grant S. Proteasome inhibitors in mantle cell lymphoma[J]. Best Pract Res Clin Haematol,2012,25(2):133-141.

[14] Rauch J, Moran-Jones K, Albrecht V, et al. c-Myc regulates RNA splicing of the A-Raf kinase and its activation of the ERK pathway[J]. Cancer Res,2011,71(13):4664-4674.

EffectofgambogicacidonproliferationandapoptosisofhumandiffuselargeB-celllymphomacelllineOCI-LY-1

SHI Xian-ping1, LAN Xiao-ying1, CHEN Xin1, WANG Wen-wen2, WEN Chuang-yu3, 4, HUANG Mei-jin4, LIU Huan-liang3,4

(1InstituteofImmunology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China;2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;3InstituteofGastroenterology,4TheSixthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China.E-mail:xianping_shi@gzhmc.edu.cn;huanliang.liu@gmail.com)

AIM: To investigate the effects of gambogic acid (GA) on the proliferation and apoptosis of human diffuse large B-cell lymphoma cells.METHODSDiffuse large B-cell lymphoma cell line OCI-LY-19 was treated with GA. The cell viability and proliferation were evaluated by MTS assay. The morphological changes of the cells were observed under inverted microscope and fluorescence microscope with PI staining. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. The changes of proteasome-related proteins Ubs, Bax, HSP90 and IκB-α, the apoptosis-related proteins PARP, pro-caspase-3 and caspase-8, and the proliferation-associated molecules ERK and STAT5 were detected by Western blotting.RESULTSThe proliferation of OCI-LY-19 cells was inhibited and the apoptosis was induced by GA. The expression of Ubs, Bax and HSP90 was up-regulated by GA treatment in a dose-dependent manner. The PARP protein was cleaved. The levels of apoptosis-related proteins pro-caspase-3 and pro-caspase-8, and proliferation-associated molecules p-Akt, p-ERK and p-STAT5 were down-regulated by GA treatment in a dose- and time-dependent manner.CONCLUSIONGambogic acid down-regulates the activity of proteasome, inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis of diffuse large B cell lymphoma.

Diffuse large B-cell lymphoma; Gambogic acid; Proteasome; Cell proliferation; Apoptosis

R733.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.008

1000- 4718(2013)05- 0815- 06

2012- 12- 31

2013- 04- 08

國家自然科學基金資助項目(No. 81100378)；廣州市科信局應用基礎研究專項重點項目(No. 2012J4100014)；廣東省醫學科研基金(No. B2012159)

△通訊作者 師憲平Tel: 020-81340313; E-mail: xianping_shi@gzhmc.edu.cn；劉煥亮 Tel: 020-39443272; E-mail: huanliang.liu@gmail.com