STAT3介導了血小板源性生長因子BB誘導的大鼠血管平滑肌細胞Pim-1表達*

孫曉東， 王 燕， 王漢琴, 2, △， 黃鐵柱

(湖北醫藥學院 1基礎醫學研究所， 2附屬太和醫院生命科學研究所， 3人體解剖學教研室，湖北 十堰 442000)

STAT3介導了血小板源性生長因子BB誘導的大鼠血管平滑肌細胞Pim-1表達*

孫曉東1， 王 燕1， 王漢琴1, 2, 3△， 黃鐵柱3

(湖北醫藥學院1基礎醫學研究所，2附屬太和醫院生命科學研究所，3人體解剖學教研室，湖北 十堰 442000)

目的觀察血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)是否可以誘導大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)表達Pim-1及Pim-1對VSMCs增殖的影響，探討STAT3信號分子在這一過程中的作用，為血管重建性疾病(VRD)的研究提供實驗依據。方法不同濃度PDGF-BB作用不同時間刺激體外培養的VSMCs，用細胞計數法檢測增殖；用real-time RT-PCR 檢測Pim-1 mRNA表達水平；Western blotting 檢測STAT3 的活性變化；用放線菌素D(actinomycin D)、AG490(JAK特異性抑制劑)及siRNA沉默Pim-1和STAT3進行干預。結果PDGF-BB(20 μg/L)作用VSMCs 24 h，可以誘導細胞增殖，Pim-1沉默抑制了這一過程；正常未經處理的VSMCs Pim-1 mRNA表達量較低，不同濃度PDGF-BB(10 μg/L～50 μg/L )作用VSMCs 1 h，Pim-1 mRNA表達明顯增加，其中以20 μg/L最顯著；用PDGF-BB(20 μg/L)作用VSMCs 不同時間(0.5 h～4 h)，可顯著上調Pim-1 mRNA表達，以0.5 h最顯著。用actinomycin D及AG490預處理后Pim-1 mRNA表達隨之降低。PDGF-BB可激活VSMCs中磷酸化STAT3水平，AG490和轉染STAT3-siRNA可抑制 STAT3的磷酸化以及相應的Pim-1 mRNA表達。結論PDGF-BB可通過Pim-1調節VSMCs增殖；STAT3可能參與了PDGF-BB誘導的VSMCs Pim-1表達。

Pim-1蛋白； STAT3轉錄因子； 血管平滑肌細胞； RNA干擾; 血小板源性生長因子BB

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖是血管重建性疾病(vascular remodeling diseases, VRD)，如高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄等共同的病理基礎。多種生長因子和細胞因子可通過與細胞膜受體的相互作用，進而激活胞內相關信號通路，啟動增殖相關基因的表達，引起 VSMCs 增殖而導致受損血管狹窄。因此，研究 VSMCs 增殖的關鍵基因及可能的信號轉導機制，對探討VRD血管重建的發生過程有重要意義。

Pim-1是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是Pim 激酶家族(現發現的有Pim-1、Pim-2和Pim-3)中的一員[1]，與其它絲/蘇氨酸蛋白激酶如絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase，Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)等類似，Pim-1能使在細胞生長通路中起關鍵作用的蛋白質分子內的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，從而引起細胞增殖、分化、轉化等生物學反應[2]。目前有關Pim-1功能的研究多集中在腫瘤細胞的增殖、凋亡及干細胞分化方面，而在非轉化細胞中的研究尚少。研究證實，血小板源性生長因子BB(platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB)能夠通過上調Pim-1基因表達調節VSMCs增殖[3]，但具體信號機制不明。新近的研究發現，肺動脈高壓患者肺動脈平滑肌細胞高表達Pim-1可能和STAT3的激活有關[4]。本研究擬探討PDGF-BB對體外培養的大鼠主動脈VSMCs Pim-1 mRNA表達的影響，以及可能參與信號轉導的STAT3活性變化，為VRD研究提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

重組人PDGF-BB購自Prospec；DMEM、LipofectamineTM2000 轉染試劑和Opti-MEM 培養基購自Invitrogen；胎牛血清購自Gibco；Trizol 購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自Promega；SYBR-Green熒光定量PCR試劑盒購自Invitrogen； actinomycin D、AG490、wortmannin和rapamycin 均購自Sigma；兔抗p-STAT3和STAT3的多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔和馬抗小鼠的Ⅱ抗購自北京中衫金橋生物技術有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，干擾序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計、合成。

二氧化碳培養箱為Thermo 產品；倒置相差顯微鏡為Olympus 產品；ScepterTM手持式細胞計數器(PHCCOOOKIT)為Milipore 產品。680 型酶標分析儀和垂直凝膠電泳槽為Bio-Rad 產品；高速冷凍離心機為Heraeus Beckman 產品；Stepone plus Real-Time PCR System 為ABI 產品。

2方法

2.1大鼠VSMCs的培養 參照文獻[5]，選6～8周齡雄性SD大鼠，3%戊巴比妥鈉麻醉后，無菌條件下取胸主動脈，眼科鑷剝離外膜，縱行切開血管，消毒棉簽擦去內膜層后，將中膜剪成1～2 mm2大小的組織塊，均勻貼在培養皿底面上，加入適量含20%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，在37 ℃含5% CO2的恒溫孵育箱中培養。3～4 d可見細胞從組織周邊爬出，1周后用0.125%胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡下見傳代細胞呈典型的“峰-谷”樣生長，免疫細胞化學染色見細胞內α-肌動蛋白呈陽性，確定為平滑肌細胞。實驗所用細胞在4～8代。

2.2逆轉錄和實時定量PCR(real-time RT-PCR) 將細胞以1×105cells/well接種于6孔培養板中，待細胞長滿孔底約70 %，換無血清DMEM饑餓同步24 h后分組進行實驗。用500 μL Trizol裂解各組VSMCs，提取總RNA并用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行real-time RT-PCR檢測，以GAPDH為內參照調整模板的濃度。實驗所用引物如下：Pim-1上游引物5’-CACGACGAAGAGATCGTCAA-3’，下游引物5’-GCTATTTGCTGGGTGATGGT-3’；STAT3上游引物5’-CGCCACTCTGGTGTTTCATA-3’，下游引物5’-CAGGAACTGCTTGATTCTTCG-3’；GAPDH上游引物5’-GGCAGCCCAGAACATCATCC-3’，下游引物5’-GCCAGCCCCAGCATCAAAG-3’。每個樣品反應總體系20 μL 。PCR 反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環。然后進行數據分析，各目的基因表達水平的變異用變化倍率(2-ΔΔCt) 來表示。

2.3siRNA干擾實驗 以1×105cells/well將細胞接種到6 孔板，待細胞生長至 70%時，用LipofectamineTM2000介導siRNA轉染，實驗方法按說明書進行。轉染36 h后，提取各組總RNA進行real-time RT-PCR檢測，提取各組總蛋白進行Western blotting檢測。Pim-1 siRNA序列正義鏈5’-CAAGGACGAGAACAUCUATT-3’，反義鏈5’-UAAGAUGUUCUCGUCCUUGAT-3’。STAT3 siRNA序列正義鏈5’-GCAGGAUCUAGAACAGAAATT-3’，反義鏈5’-UUUCUGUUCUAGAUCCUGCTT-3’。

2.4細胞計數 取對數生長期的VSMCs以 2×104cells/well 的密度種到 24孔板中，待細胞生長至 70 % 時，先進行Pim-1干擾實驗，后再加入PDGF-BB(20 μg/L)繼續培養 24 h，胰酶消化法收集細胞，用ScepterTM細胞計數器進行細胞計數。

2.5蛋白免疫印記(Western blotting) 收集各組的VSMCs，用冰PBS洗3次，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液冰上處理20 min，離心后吸取上清。用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，蛋白上樣量30 μg。轉膜后用5 % 脫脂奶粉的TBST封閉2 h，分別加兔抗p-STAT3和STAT3的多克隆抗體(1∶1 000)；鼠抗tubulin的多克隆抗體(1∶500)，4 ℃ 孵育過夜；TBST洗膜后加堿性磷酸酶標記的山羊抗兔和馬抗小鼠的Ⅱ抗(1∶1 000)，室溫搖床上孵育2 h，洗膜后用5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑氮藍顯色液膜上顯色，掃描后進行圖像灰度分析。

2.6Actinomycin D、AG490、wortmannin和rapamycin的使用 用DMSO溶解基因轉錄阻斷劑actinomycin D、JAK抑制劑AG490、PI3K抑制劑wortmannin和mTOR抑制劑rapamycin。接種于6孔板的VSMCs同步24 h后，加入actinomycin D (1 mg/L)、AG490(100 mmol/L)、rapamycin(200 μmol/L)和wortmannin(200 μmol/L)，加入同體積的DMSO為對照，孵育20 min，再加入PDGF-BB(20 μg/L)作用30 min。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean ± SD)表示。組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1Pim-1對PDGF-BB誘導的VSMCs增殖的影響

Real-time RT-PCR檢測結果如圖1A所示，篩選出的有效片段能有降低VSMCs 中Pim-1 mRNA 水平(P<0.05)，而對Pim-3 沒有影響。轉染后的各組細胞，用PDGF-BB孵育24 h，VSMCs明顯增殖，而siPim-1+PDGF-BB組顯著抑制了PDGF-BB 誘導的VSMCs 增殖(P<0.05),見圖1B。

Figure 1.Pim-1 gene silencing (A) suppressed the proliferation of VSMCs induced by PDGF-BB (B).Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiSCR or Lip;△P<0.05vscontrol;#P<0.05vssiSCR+PDGF-BB.

圖1沉默Pim-1基因抑制PDGF-BB誘導的VSMCs增殖

2PDGF-BB對VSMCsPim-1mRNA表達的影響

接種于6孔板的VSMCs同步24 h后，以不同濃度的PDGF-BB作用相同時間(1 h)，結果如圖2A所示。與對照組比，除 5 μg/L組外，10 μg/L、20 μg/L和50 μg/L各組均能明顯增強Pim-1 mRNA的表達(P<0.05)，以20 μg/L組最顯著。以同一濃度(20 μg/L)的PDGF-BB作用不同時間，結果如圖2B所示，VSMCs中Pim-1 mRNA在短時間(0.5 h)作用組表達最強，隨PDGF-BB作用時間延長而減弱。

3各種阻斷劑對PDGF-BB誘導的Pim-1mRNA表達的影響

如圖3所示，與未加阻斷劑組相比，用actinomycin D和AG490預處理的 VSMCs中Pim-1 mRNA的表達顯著降低(P<0.05)，而用wortmannin(PI3K抑制劑)和rapamycin(mTOR抑制劑)預處理的VSMCs中Pim-1 mRNA表達都有明顯上升(P<0.05)。

4PDGF-BB激活STAT3

Figure 2. Effects of PDGF-BB on the expression of Pim-1 mRNA in VSMCs.A: different concentrations of PDGF-BB for 1 h; B: 20 μg/L PDGF-BB for different time.Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;▲P<0.05vs5 μg/L;#P<0.05vs10 μg/L;△P<0.05vs0.5 h.

圖2PDGF-BB誘導VSMCs中Pim-1mRNA表達

Figure 3. Effects of actinomycin D，AG490，wortmannin and rapamycin on Pim-1 mRNA expression induced by PDGF-BB.Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsPDGF-BB.

圖3ActinomycinD、AG490、wortmannin和rapamycin對PDGF-BB誘導的VSMCsPim-1mRNA表達的影響

PDGF-BB(20 μg/L)作用不同時間，Western blotting結果顯示(圖4A)，與0 min相比，PDGF-BB作用5 min可顯著激活VSMCs p-STAT3表達，15 min、30 min、60 min和120 min后，隨時間的延長逐漸減弱。用JAK抑制劑AG490預孵育20 min后，再用PDGF-BB 刺激10 min，如圖4B所示，與未加抑制劑組相比，p-STAT3的表達明顯被抑制。

Figure 4. Western blotting was performed to detect the effect of PDGF-BB on phosphorylated STAT3 (p-STAT3) expression. A:20 μg/L PDGF-BB for different time;B:effects of PDGF-BB and JAK inhibitor AG490. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 min;△P<0.05vscontrol;#P<0.05vsPDGF-BB.

圖4免疫印跡法顯示PDGF-BB對STAT3蛋白磷酸化的影響

5沉默STAT3對VSMCsPim-1mRNA表達的影響

Real-time RT-PCR檢測結果如圖5A所示，篩選出的有效片段能有效降低VSMCs 中STAT3 mRNA 水平(P<0.05)，而對STAT1沒有影響。轉染后的細胞提取蛋白，Western blotting結果如圖5B所示，siSTAT3明顯抑制了STAT3蛋白表達量(P<0.05)。轉染后的各組細胞，用PDGF-BB孵育1 h，real-time RT-PCR結果如圖5C所示，與siSCR+PDGF-BB相比，siSTAT3+PDGF-BB顯著抑制了Pim-1 mRNA表達(P<0.05)。

Figure 5. Small interfering RNA (siRNA) forSTAT3 (A:STAT3 mRNA;B:STAT3 protein) suppressed Pim-1 mRNA expression induced by PDGF-BB (C).Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiSCR or Lip;△P<0.05vssiSCR;▲P<0.05vscontrol;#P<0.05vssiSCR+PDGF-BB.

圖5siSTAT3轉染VSMCs后對PDGF-BB誘導的Pim-1mRNA表達的影響

討 論

研究發現，PDGF-BB可以通過Pim-1調節細胞周期蛋白p21而促進VSMCs增殖[3]；肺動脈高壓后肺動脈血管壁平滑肌細胞增殖和高表達Pim-1有關[4]；還證實Pim-1作為一種VEGF的反應基因，參與調節球囊損傷后的VSMCs的增殖[6]，提示Pim-1可能是促進VSMCs增殖的相關基因。

我們首先證實沉默Pim-1基因后，能抑制PDGF-BB誘導的VSMCs增殖，這一結果與文獻報道一致[3]。接下來觀察PDGF-BB對Pim-1 mRNA表達的影響及可能的信號機制,結果發現Pim-1 mRNA在正常未經處理的VSMCs上表達較低，低濃度PDGF-BB(5 μg/L)不能上調Pim-1 mRNA表達，濃度在10～50 μg/L則可顯著上調Pim-1 mRNA表達。從時間梯度結果來看，選擇PDGF-BB(20 μg/L)刺激細胞30 min，即可顯著上調Pim-1 mRNA表達，維持到1 h后隨之降低，說明 PDGF-BB瞬時(transient)調節Pim-1 mRNA表達，這一結果與已有的報道一致[7-8]。另外，由于mRNA水平的多少主要取決于該基因轉錄活化的程度與生成mRNA的穩定性[9]，我們用基因轉錄抑制劑(actinomycin D)預處理VSMCs，發現actinomycin D完全阻斷了PDGF-BB誘導的Pim-1 mRNA表達，說明PDGF-BB上調Pim-1 mRNA是發生在轉錄水平。

STAT3蛋白是近年來研究異常活躍的轉錄因子，在細胞因子和生長因子的作用下，通過JAK 或絲氨酸激酶誘導，STAT3被激活并形成p-STAT3，進入細胞核后與目的基因的啟動子區域結合，調節靶基因轉錄。通過基因芯片技術，有研究發現在人T細胞內，活化的STAT3能直接與Pim-1啟動子上GAS序列結合而使Pim-1基因表達上調[10]。據此，我們推測PDGF-BB可能是通過JAK/STAT3信號通路來調節Pim-1 mRNA表達。為了驗證這一推測，我們先用AG490(JAK特異性阻斷劑)預處理VSMCs，發現AG490明顯抑制了PDGF-BB誘導的Pim-1 mRNA表達，通過Western blotting方法，證實PDGF-BB可以促進STAT3蛋白的活化，AG490可以阻斷VSMCs中STAT3的活化，從而下調Pim-1 mRNA表達。分析Western blotting結果還發現，PDGF-BB激活STAT3蛋白發生在PDGF-BB刺激5 min，活化的STAT3維持到30 min 后逐漸減弱，而Pim-1 mRNA表達最高發生在PDGF-BB誘導30 min，也就是說PDGF-BB誘導Pim-1 mRNA表達在PDGF-BB活化STAT3之后發生，這一結果和高糖基化終產物受體誘導VSMCs表達Pim-1相似[8]，也提示STAT3可能有調節Pim-1 mRNA表達的作用。這一點在下一步通過siRNA靶向沉默STAT3后得到了證實，STAT3基因沉默后，PDGF-BB不能上調Pim-1 mRNA表達。以上結果證明了PDGF-BB是通過JAK/STAT3信號通路來調節Pim-1 mRNA表達變化，但活化的STAT3是否與Pim-1 啟動子序列結合而調節Pim-1的轉錄，還有待后續實驗進一步證實。另外，在這個實驗中，我們還用了PI3K抑制劑(wortmannin)和mTOR抑制劑(rapamycin)，發現Pim-1 mRNA表達沒有被抑制，相反是顯著上調，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路可能對Pim-1的調節呈現負性調控，這一點也有待進一步探討。

本文觀察了PDGF-BB對大鼠VSMCs中Pim-1 mRNA表達的影響，發現PDGF-BB(20 μg/L)對Pim-1表達影響最大，并呈現瞬時性，而且與JAK/STAT3信號通路有關。這些結果提示，Pim-1可能是PDGF-BB誘導VSMCs增殖的下游靶基因之一，PDGF-BB可能通過Pim-1改變VSMCs的遷移、增殖等功能而調節血管重建。

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STAT3mediatesPDGF-BB-inducedPim-1expressioninratvascularsmoothmusclecells

SUN Xiao-dong1, WANG Yan1, WANG Han-qin1, 2, 3, HUANG Tie-zhu3

(1InstituteofBasicMedicalSciences,2InstituteofLifeSciences,TaiheHospital,3DepartmentofHumanAnatomy,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China.E-mail:hanqinwang111@yahoo.com.cn)

AIM: To study the expression of Pim-1 in vascular smooth muscle cells (VSMCs) induced by platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB).METHODSVSMCs isolated from rats were treated with different concentrations of PDGF-BB for different time. The proliferation of VSMCs was detected by cell counting. The mRNA expression of Pim-1 was measured by real-time RT-PCR. The STAT3 activity was determined by Western blotting. Actinomycin D, AG490, and small interfering RNA (siRNA) forPim-1 orSTAT3 were used to investigate the underlying mechanisms.RESULTSPim-1 gene silencing attenuated the proliferation of VSMCs in response to PDGF-BB. The mRNA expression of Pim-1 was up-regulated by PDGF-BB at concentrations of 10 μg/L～50 μg/L for 1 h, and was maximally induced at the concentration of 20 μg/L. The time of Pim-1 mRNA expression maximally occurred 30 min after PDGF-BB exposure. Incubation of VSMCs with PDGF-BB resulted in a significant activation of STAT3. VSMCs pretreated with actinomycin D showed a significant decrease in the mRNA expression of Pim-1. Treatment with AG490 or knockdown ofSTAT3 in VSMCs resulted in inactivation of STAT3, and significantly suppressed the mRNA expression of Pim-1.CONCLUSIONPDGF-BB-induced VSMC proliferation is partly attributed to Pim-1. VSMCs strongly increase Pim-1 mRNA upon stimulation with PDGF-BB, and STAT3 signaling pathway appears to be efficient for regulation of Pim-1 expression. This process may play a critical role in development of vascular remodeling.

Pim-1 protein; STAT3 transcription factor; Vascular smooth muscle cells; RNA interference; Platelte-derived growth factor BB

Q78

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.006

1000- 4718(2013)05- 0804- 06

2012- 11- 12

2013- 03- 26

國家自然科學基金資助項目(No. 30770535)；湖北省高等學校優秀中青年科技創新團隊計劃(No.T201008)；湖北省自然科學基金資助項目(No. 2012FFB03903)

△通訊作者 Tel: 0719-8891156; E-mail: hanqinwang111@yahoo.com.cn