益腎達絡飲對EAE小鼠NgR、Gap-43表達的影響

尚曉玲，樸松蘭，呂野夫

(長春中醫藥大學，長春 130117)

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是發生于中樞神經系統(CNS)由T細胞介導的慢性自身免疫性脫髓鞘疾病(experimental allergic encephalomyelities，EAE)，其復發率和病殘率較高。臨床實踐表明，以益腎解毒通絡法為主的中藥復方益腎達絡飲，在減輕MS臨床癥狀、減少復發方面具有較好的療效。為進一步探討其治療機理，我們進行了益腎達絡飲對EAE小鼠神經損傷后的修復研究。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級8～12周齡的SJL/J雌性小鼠40只，體質量18～20g，由美國 Jackson實驗室提供，動物飼養在吉林大學實驗動物中心。SJL/J小鼠在實驗前清潔飲水，自由飲食。

1.2 藥品與試劑

抗原 PLP139-151(HSLGKWLGHPDKF)多肽購自北京賽百盛生物工程公司，純度85%以上;百日咳桿菌購自北京生物制品研究所;完全福氏免疫佐劑購自美國Sigma公司;MCP-1免疫組化、原位雜交試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;醋酸潑尼松購自天津天藥藥業有限股份(批號1006042)，經研缽粉碎后以雙蒸水溶解，充分混勻，配成0.039%濃度，4℃保存，使用前混搖均勻;益腎達絡飲(由熟地、鹿角膠、梔子、石菖蒲、生甘草等組成)飲片購自長春中醫藥大學附屬醫院藥房，經常規方法煎煮后制成2g生藥/mL的水提物，分裝滅菌后4℃保存備用;NgR、Gap-43免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 動物模型制備

用PLP139-151制作抗原免疫小鼠:將 100μL PLP139-151 水 溶 液 (含 PLP139-151 150μg)與100μL完全福氏免疫佐劑(含結核桿菌H37RA400μg)混合，充分乳化制成油包水的抗原配劑。第1天給予SJL/J小鼠上腹部皮下注射0.2mL的抗原配劑，第1天和第3天給予靜脈注射0.1 ml(含0.6×106個百日咳桿菌)百日咳桿菌液。

1.4 動物分組及給藥

實驗小鼠共隨機分為正常組、模型組、激素組、中藥組4組，每組10只。正常組不做任何處理，模型組造模后7d開始每天給予生理鹽水0.2ml灌胃14d，中藥組造模后7d開始每天按每公斤體重2g生藥量給予益腎達絡飲0.2ml灌胃14d，激素組造模后7d開始每天按每公斤體重0.078mg給予0.2ml醋酸潑尼松灌胃14d。

1.5 神經功能評價

免疫后所有動物每天稱體重并進行神經功能評價，動物發病程度的判斷根據Knono等提出的標準，發病后動物出現不同程度的神經功能缺損，可見動物尾部無力，尾部無力加肢體無力，肢體輕度麻痹，肢體嚴重麻痹，被動翻身后不能復原和瀕死狀態。

1.6 標本制作、切片及染色

實驗小鼠在造模后22d取材。免疫組化取材用10%水合氯醛經腹腔注射麻醉小鼠，剪開胸部將灌注針由左心室穿入主動脈，依次注入0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛。經心灌注30min后，完整取出腦和脊髓固定于0.1kg/L福爾馬林磷酸緩沖液中24h，石蠟包埋以備切片。取出石蠟塊連續切片，片厚3μm，37℃烤干切片備用。

蘇木素-伊紅(HE)染色:取石蠟片、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15min;下行梯度酒精各5min;自來水洗20s;Harries蘇木精1min;自來水洗20s;鹽酸酒精10s;自來水洗返藍10s;伊紅染色10min;自來水洗20s，85%酒精、95%酒精、100%酒精各5s;二甲苯透明各10 min;中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

免疫組化染色(ABC法):切片脫蠟至水，復合消化液消化，PBS漂洗。加入適當稀釋的一抗(p38單抗稀釋為1∶100)，4℃冰箱孵育過夜。加生物素化二抗和ABC復合物孵育各30min，顯微鏡下觀察，DAB顯色。各步驟前用0.1mol/LPBS(pH7.4)沖洗5min×3次。梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。采用Image-Pro Plus 6.0彩色病理圖文分析系統，在20倍物鏡下由計算機自動算出陽性物質的積分光密度和標準差，對染色結果進行分析。

1.7 統計學方法

采用SPSS 15.0 for Windows軟件處理。文中實驗所測數據以均數±標準差(珋x±s)表示，進行態性檢驗和方差齊性檢驗，經 One-Way ANOVA進行方差齊性檢驗后，選用S-N-K進行多組比較。

2 結果

2.1 腦組織的病理形態變化

HE染色后，正常小鼠腦組織神經細胞胞核、胞質分明，組織無結構紊亂。造模后EAE小鼠出現血管周圍大量炎性細胞浸潤，部分神經細胞核固縮，灰質白質均受影響。炎性反應在腦室周圍、小腦、腦干都有發生(圖①②)。

2.2 各組小鼠腦組織 NgR、Gap-43蛋白表達情況

NgR免疫組化染色胞漿呈棕褐色的細胞為NgR陽性細胞。正常腦陽性細胞較為稀少，染色較淺。在模型組、激素組、中藥組損傷區域均可見陽性細胞增多，胞體增大，胞漿深染，主要以彌漫的形式分布在灰質區域(圖③-⑥)。

Gap-43免疫組化染色顯示，胞漿呈棕黃色的細胞為Gap-43表達的陽性細胞。Gap-43正常組中很少表達，模型組、激素組、中藥組均有表達，陽性染色物質主要沉積于神經元。模型組、激素組、中藥組均有表達(圖⑦-⑩)。

中樞神經系統NgR、Gap-43蛋白含量比較

結果顯示，NgR表達根據多項比較組間P值可知，正常組和中藥組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，與其余組比較差異有極顯著統計學意義(P值均＜0.01);模型組和激素組、中藥組比較差異均有統計學意義(P值均＜0.01);激素組和中藥組比較差異無統計學意義;Gap-43根據多項比較組間P值可知，正常組和模型組比較差異無統計學意義，正常組和激素組、中藥組比較差異有極顯著統計學意義(P值均 ＜0.01);模型組和中藥組、激素組比較差異有極顯著統計學意義(P值＜0.01);激素組和中藥組比較差異有極顯著統計學意義(P值＜0.01)。

3 討論

EAE具有與多發性硬化(MS)相似的臨床表現和病理改變，是國際公認的研究人類MS的理想動物模型。EAE發病后伴隨免疫性炎癥的逐漸加重，神經功能缺損的癥狀以及病理改變反映出神經損傷隨即發生，因而控制髓鞘脫失、軸突損傷、促進神經再生已經成為本病的研究熱點。CNS再生障礙是腦和脊髓永久性損傷的主要原因，神經再生抑制蛋白是阻礙神經再生的主要因素之一。目前發現的神經再生抑制蛋白有很多，其中 MAG、OMgp和 Nogo相繼被分離和鑒定，它們均能通過與Nogo-A受體NgR的結合而發揮作用。Nogo-A是目前已知最強的神經軸突生長抑制因子，與特異性NgR結合［1］，從而抑制神經細胞軸突的再生并導致軸突生長錐變性萎縮的功能。本實驗檢測EAE小鼠CNS中NgR含量發現，其表達水平遠遠高出正常水平，提示 EAE發病后不僅出現神經損傷，同時表現出神經再生被抑制的情況，給予激素、中藥干預的 EAE小鼠則NgR含量明顯低于模型組水平，證明激素、中藥都可以降低神經再生抑制蛋白表達，二者比較差異無統計學意義，均可下調Ng R表達水平，以阻止神經元修復機制進一步受損，恢復一個新的生長抑制與促進的平衡。據此表達規律，結合小鼠減輕的EAE癥狀分析，激素、中藥都可以進行干預其表達，通過減輕神經再生抑制程度促進神經再生。

Das Sarma J實驗表明，軸突損傷與患病后的肢體殘疾直接相關，是影響治療和康復的重要因素，軸突損害越重，MS的預后越差［2］。生長相關蛋白(growth associated protein-43，GAP-43)是神經組織特異性磷酸蛋白，被認為是神經元軸突生長發育和可塑性的分子標記物［3］，與神經生長密切相關。GAP-43可促進神經元的生長發育及突觸的重構，在神經損傷后修復時，軸突內GAP-43的含量可增加20～100倍［4］。GAP-43高表達被認為是神經生長修復的典型特征。單靠CNS損傷后自身有限的可塑能力和損傷刺激產生的有限的GAP-43促進神經再生常常不足以完全代替神經損傷，所以一些無法修復代償的損傷造成了后遺癥。中醫藥在臨床中治療有神經損傷的疾病有一定療效，尤其能改善部分神經功能缺損癥狀。本實驗結果表明，EAE發病神經損傷后神經再生也活躍起來，模型組表達量比較低，中藥益腎達絡飲、激素都能促進Gap-43表達量增加，而中藥復方與激素比較差異有極顯著統計學意義，此實驗結果與臨床中通過益腎達絡飲的治療可以較好減輕神經功能缺損程度的療效是一致的。

神經再生的障礙是由于神經生長抑制因子及膠質瘢痕屏障，很少有神經纖維跨越損傷區而進入遠端，并建立功能性突觸聯系。如何克服抑制因子的作用和消除膠質瘢痕屏障，是今后研究的核心。在消除膠質瘢痕方面，目前還沒有有效的辦法。中醫治療以整體觀念為指導，通過調整陰陽影響機體的多個系統，產生多層面的協調作用，此綜合作用體現在降低炎性因子［5］、影響信號轉導通路［6］、下調神經再生抑制蛋白表達、促進軸突再生［7］等方面，均對CNS的反應性再生、結構重建起到積極作用，這將對于CNS損傷的后期康復治療都具有十分重要的意義。然其表現出的促進神經再生、抑制瘢痕形成的作用機制遠比想象復雜得多，有待于進一步深入研究。`

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［5］ 尚曉玲，高穎，尹嶺，等.益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎 MCP-1的影響［J］.天津中醫藥，2006，23(5):404-407.

［6］ 尚曉玲，高穎，王碩仁，等.實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠p38的變化及益腎達絡飲的影響［J］.2009(3):478-480.

［7］ 尚曉玲，高穎，尹嶺，等.益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎β淀粉樣前體蛋白的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2008，14(9):664-666.