熊膽粉對腦缺血損傷大鼠神經行為學障礙及神經細胞凋亡的影響

富 蘇，韓經丹，周 杰，范吉平△

(1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700;2.中國中醫科學院，北京 100700;3.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102)

近幾年，在各種腦缺血模型中均看到神經元壞死伴有凋亡發生，并認為凋亡是缺血性神經元死亡的一種形式。研究證實，缺血性腦損傷時的細胞死亡不僅存在壞死，而且會有大量細胞凋亡［1，2］。細胞凋亡成為腦缺血損傷中的研究熱點，并成為開發治療藥物的治療靶點。熊膽粉味苦性寒，歸肝、膽、心、胃經，功用清熱解毒。導師范吉平教授依據多年中風病治療的臨床經驗發現熊膽粉對腦缺血損傷具有良好的保護作用，既往臨床試驗也證實以熊膽粉為君藥的通絡化痰膠囊可減少腦梗死病人的神經功能缺損癥狀［3］。本研究將試圖探討熊膽粉對腦缺血損傷大鼠神經行為學、腦組織病理學、神經細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD雄性健康成年大鼠，體質量320～350g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號SCXK(京)2006-0009)。

1.2 藥物

熊膽粉:由山東沃華醫藥科技股份有限公司提供;陽性對照藥物尼莫地平(商品名:尼膜同):購于拜耳醫藥(國藥準字 H20003010，生產批號BJ03850)。

1.3 主要儀器和試劑

恒溫手術臺(SHOR-LINE);MCAO線栓(沙東線栓);電子分析天平(Sartorius);Narrow-Alley Corner Test實驗儀器(北京寬街醫院);石蠟包埋機(Leica，EG1150H);石蠟切片機(Leica，RM2255);正置顯微鏡(Olympus BX51);光學照像生物顯微鏡(Leica，DMLB-HC);圖像采集系統(Leica DM4000B);圖像分析系統(Image-pro Plus 5.0)。

水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司);0.9%生理鹽水(石家莊四藥);4%多聚甲醛(SUNBIO);超純水(中國中醫科學院醫學實驗中心機能實驗室);乙醇、二甲苯、鹽酸酒精、伊紅(北京化工廠)蘇木精(北京化學試劑公司);TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德)。

1.4 造模方法

大鼠經10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mL·100 g－1)，大鼠麻醉成功后仰臥位固定，頸部正中切口，分離并暴露右側頸總動脈及頸內、外動脈，頸總動脈近心端和頸內動脈搭一根尼龍線系活扣，頸外動脈近心端和遠心端分別用一根尼龍線結扎，兩根結扎尼龍線之間間距0.5 cm。頸總動脈動脈夾加閉后，在頸外動脈上兩根結扎的尼龍線之間剪短，后將頸外動脈近心端下翻，與境內動脈成一天直線，從頸外動脈減一個小口，插入線栓，插入長度約為(20.0±0.5)mm時感到有輕微阻力時停止，在頸內動脈處扎緊尼龍線并固定線栓，并扎緊頸總動脈近心端尼龍線，取下動脈夾，縫合皮膚。術后常規護理。待實驗動物清醒后，進行Zea-Longa神經功能評分，神經功能評分標準為:a.無神經功能損傷癥狀，動物正常活動，進食評0分;b.將動物尾巴提起后，左前肢屈曲1分;c.將動物放置平板上，向左側轉圈2分;d.將動物放置平板上，用手輕推向左側傾倒3分;e.動物左側偏癱，不能自發行走意識朦朧或喪失4分。評分大于或等于2分，則表明模型成功，低于2分則予以去除。

1.3 分組和給藥

造模成功的實驗動物，根據神經功能評分分層隨機分為5組，分別為正常對照組(蒸餾水)、假手術組(蒸餾水)、模型組(蒸餾水)、尼莫地平組(尼莫地平研碎蒸餾水溶解，按照臨床用量人大鼠體表面折算給藥劑量為32.4 mg·kg－1，配制成藥物濃度為3.24 mg·mL－1的蒸餾水溶液)、熊膽粉組(通絡化痰膠囊蒸餾水溶解，按照臨床用量人大鼠體表面折算給藥劑量為27 mg·kg－1，配制成藥物濃度為2.7 mg·mL－1的蒸餾水溶液)。從術后第1天開始給藥，以1 mL·100 g－1體重體積灌胃給藥，每天 1 次，連續灌胃給藥7d。

1.4 行為學測試

于術 后第 1、2、3、5、7 天進行 Narrow-Alley Corner Test行為學測試。Narrow-alley Corner Test是被國外學者廣泛使用的2種神經行為學實驗，主要用以檢測大鼠“不對稱感覺運動功能障礙”(asymmetrical sensorimotor dysfunction)［4，5］。不對稱分值=(向右側作站立轉身的次數/總的站立轉身的次數)×100%，正常基線為50%，分值越高，反映損傷越嚴重。

1.4 取材及標本制作

術后第8天每組隨機取6只，10%水合氯醛深度麻醉(0.35 mL·100 g－1)，迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動脈，快速注入100 ml生理鹽水沖洗后，再以體積分數為4%的多聚甲醛(PH值調成7.0左右)灌注固定后斷頭取腦。取得的腦組織入4℃4%多聚甲醛固定液中固定過夜，經過固定、脫水、透明、石蠟包埋處理，連續冠狀切片，切片厚度為5μm。

1.5 HE染色和尼氏染色

上述標本行HE染色，光鏡下觀察缺血側腦缺血區及其周圍組織的病理學變化。

1.6 TUNEL法測細胞凋亡

組織切片，常規脫蠟，抗原修復后用 0.3%H2O2封閉內源性過氧化物酶活性，滴加TUNEL反應混合溶液，37℃避光孵育60 min，滴加轉化劑，37℃孵育30 min，DAB顯色、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。陰性對照不加TDT。首先在40倍光鏡下定位缺血側缺血半暗帶額頂葉皮層，每組6只，每只動物取5張相同部位腦片，后在400倍光鏡下選取5個相鄰視野對陽性神經元(胞漿呈棕黃色顆粒)進行觀察，采用 Image-pro Plus 5.0軟件計數陽性細胞數。

1.7 統計學處理

實驗數據以均數±標準差(珋x±s)表示，采用SPSS軟件作統計分析，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 熊膽粉對pMCAO大鼠神經行為學測試的影響

各組大鼠造模后缺血 1、2、3、5、7d Narrow Alley Corner Test評分結果見下表1。正常對照組和假手術組大鼠沒有神經功能缺損癥狀，各缺血組大鼠神經缺損癥狀表現明顯，與正常對照組和假手術組有顯著統計學差異(P＜0.01)，但隨著缺血時間的延長而逐漸的自行恢復，而熊膽粉組和尼莫地平組大鼠神經缺損癥狀的恢復速度快于模型組，與模型組有差異(P＜0.01，P ＜0.05)。

2.2 熊膽粉對pMCAO大鼠缺血側病理學改變的影響

正常對照組和假手術組神經細胞排列有序，未見水腫，胞體、核仁、核仁清晰。模型組大鼠缺血側壞死區范圍明確，壞死區內可見間質內大小不等的空泡，其間散在著神經細胞;部分神經細胞核固縮、深染，未見核仁;部分神經細胞核溶解、胞漿疏松，細胞界限不清;大部分細胞有退形性變，神經細胞內病變較彌漫，可見深藍色、新月樣凋亡細胞。熊膽粉組和尼莫地平藥組大鼠腦組織可見壞死區減小，其周邊可見神經細胞、胞漿、胞核尚能分清，可見細胞帶有中斷，有細胞脫失，結構完整可辨的神經元數量較多，變性壞死組織范圍相對較小、程度較輕。

Table 1-1 Effect of Bear bile power on the Nar row-Alley Corner Test of Rats with p MCAO(珋x±s)

Fig.1 Effect of Bear Bile Power Capsule on the morphological changes in the cerebral cor tex induced of rats with p MCAO(HE staining×400)A.normal group B.sham group C.model group D.nimodipine group E.BBP group

Fig.2 Effect of Bear Bile Power on the neuronapoptosis of ischemic penumbra of rats with p MCAO(TUNEL×400)A.normal group B.sham group C.model group D.nimodipine group E.BBP group

2.3 熊膽粉對pMCAO大鼠缺血半暗帶神經細胞凋亡的影響(TUNEL法)

表2圖2顯示，正常對照組和假手術組未見明顯凋亡細胞。模型組大鼠缺血半暗帶皮層可見大量的凋亡細胞，與正常對照組和假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。凋亡細胞核被染成棕褐色，表現為細胞核固縮，胞體縮小變形、破裂成小碎片或出現凋亡小體。與模型組比較，尼莫地平和熊膽粉給藥干預后其凋亡細胞數顯著降低(P＜0.01)，具有明顯的抑制細胞凋亡的作用。

Table 2 Effect of Bear bile power on the neuron apoptosis ofischemic penumbra of rats with p MCAO(x珋±s)

4 討論

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡(programed cell death，PCD)，是由基因控制的細胞自主有序的死亡。MacManuS等在1993年首次報道大鼠全腦缺血與神經細胞凋亡的關系，至此之后神經細胞凋亡在腦缺血損傷中的作用日益受到關注。研究表明，神經細胞凋亡是腦缺血損傷病理作用的重要環節，是造成腦缺血損傷后繼發性損害的重要機制［6，7］。腦缺血損傷既可造成細胞壞死，又可誘導細胞凋亡。細胞壞死是一個不可逆的過程，而細胞凋亡則是受一系列程序調控的過程，在腦缺血損傷后及早進行抗凋亡治療具有重要意義［8］。

熊膽粉味苦性寒，歸肝、膽、心、胃經，功用清熱解毒。既往研究觀察注射用熊膽粉對腦血栓、腦缺血動物模型的影響，結果注射用熊膽粉可明顯抑制大鼠體內外血栓的形成，降低血液黏度，改善血液流變性，抑制血小板聚集，降低血小板黏附性，改善血栓性缺血腦組織病變程度，降低毛細血管通透性，且可降低損傷腦組織中丙二醛(MDA)水平，保護超氧化物歧化酶(SOD)活性，注射用熊膽粉對腦缺血有保護和治療作用［9］。腦缺血損傷后的級聯反應所形成的一系列神經生化毒素，導致神經功能損害，當屬中醫學痰、瘀、毒邪范疇，亦為應用中藥抑制或阻斷缺血后級聯反應成為中醫藥治療中風病的特色機制。本研究揭示，腦缺血損傷后早期應用熊膽粉對神經功能障礙的恢復、腦組織病理學改變有著一定的作用，其機制可能與熊膽粉可挽救缺血半暗帶神經細胞凋亡有著一定的關系，然而熊膽粉減少缺血半暗帶皮層神經元凋亡的機制還有待于研究進一步揭示。

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