補腎活血方對骨質疏松癥大鼠TGF-β1表達影響的拆方研究

韓麗萍，王相東，魏敏惠，劉 實，史亞軍，王小寧，方改英，張小琴

(1.陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046;2.寶雞市中醫醫院，陜西 寶雞 721000)

前期實驗［1，2］表明，補腎活血中藥仙鹿壯骨方能提高骨質疏松模型大鼠骨密度和I型膠原基因表達，改善骨組織形態，對防治骨質疏松癥具有良好效果。為進一步探討該方不同配伍之間對骨質疏松癥大鼠的治療作用及其配伍規律，我們對仙鹿壯骨方進行拆方研究，分別檢測該方君臣佐各組藥物組合對骨質疏松模型大鼠的骨密度、轉化生長因子的影響，并將結果報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物來源及分組

選用4月齡SD雌性大鼠153只(西安交通大學醫學院提供，動物級別:二級，合格證號醫東字第08005 號)，體質量200 ～250g，隨機分為13 組:1、君臣大劑量組;2、君臣小劑量組;3、君佐大劑量;4、君佐小劑量組;5、臣佐大劑量組;6、臣佐小劑量組;7、佐藥大劑量組;8佐藥小劑量組;9、全方大劑量組;10、全方小劑量組;11、西藥組;12、模型組;13、空白組。

1.2 藥物來源及分組

仙鹿壯骨方由淫羊藿20g、菟絲子10g、鹿角膠5g、杜仲 10g、骨碎補 10g、三七 3g、山楂 10g 組成。該方君藥為淫羊藿、菟絲子;臣藥為:鹿角膠、骨碎補、杜仲;佐藥為:三七、山楂。隨實驗動物進行相應分組。各組藥物由陜西中醫學院制劑室按照實驗要求及制藥標準制備。

造模所用的地塞米松磷酸鈉注射液，由湖北天藥藥業股份有限公司生產，國藥準字:H42020019，產品批號:20051109。西藥:新蓋中蓋高鈣片，哈藥集團制藥六廠，批號:20060116-2。麻醉劑:鹽酸氯胺酮注射液，福建古田藥業有限公司(批號050504，規格:2ml:0.1g)。

1.3 主要試劑與儀器

血清骨鈣素(BGP)放免藥盒由解放軍總醫院科技開發中心提供;放射免疫測定用美國Roche公司Elecsys2010檢測儀器;HPIAS-1000型高清晰度彩色圖像分析系統，CCD130萬像素熒光顯微鏡，XSY-I型號，重慶光學儀器廠提供;骨密度檢測用 QDR-2000型雙光能X線骨密度儀，美國HOLOGIG公司產品。

2 方法

2.1 給藥方法

除空白組外，其余組均以地塞米松0.1mg/100g，每周2次肌肉注射造成骨質疏松模型。中藥實驗組大鼠，分別按照分組，用中藥湯劑灌胃。具體用量見表1、表2;西藥組以10IU/100g新蓋中蓋藥液灌胃，每日1次，加維生素D 3肌肉注射6萬U/kg，每2周1次。模型組和空白組以1ml/100g蒸餾水灌胃，每日1次。用藥觀察12周后全部處死取材。

2.2 檢測方法和指標

2.2.1 骨密度檢測 取動物一側股骨連同膝關節，送第四軍醫大學骨科研究室檢測骨密度;

2.2.2 轉化生長因子檢測(TGF-β1) 在膝關節處取材、固定，PBS漂洗、脫鈣、漂洗、包埋，切取5um厚組織裱于APES包被過的載玻片上。37℃烤干，－20℃存放，然后進行免疫組織化學染色觀察TGF-β 表達。

3 結果

3.1 骨密度值

表1顯示，模型組BMD降低，與空白組比較差異有統計學意義(P＜0.05);用中西藥治療后，各組骨密度均有提高(P＜0.05);全方大劑量、君臣大劑量與西藥組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，全方組與君佐及佐藥組比較差異有統計學意義(P＜0.05);君臣組與佐藥組比較差異有統計學意義(P＜0.05);中全方大小劑量組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組骨密度值BMD值(g/cm2)

3.2 TGF-β1在大鼠股骨組織中表達情況

表 2 TGF-β1表達情況

表2顯示，模型組 TGF-β1值明顯降低，說明造模成功;治療組中大部分和模型組比較(P＜0.05)，說明治療有效果;全方大劑量組與臣佐大劑量組、佐藥大劑量組比較(P＜0.05)，說明全方大劑量組效果明顯優于以上2組;全方大劑量組和西藥組比較(P＞0.05)，說明全方大劑量組和西藥效果相當。

4 討論

TGF-β1是調控骨代謝最為重要的細胞因子，也是骨組織中含量最豐富的生長因子，主要由成骨細胞(OB)合成、分泌，被認為是成骨細胞與破骨細胞(OC)之間耦聯的重要生長因子［3］。它具有刺激間充質細胞的增殖與分化、促進成骨細胞、成軟骨細胞的增殖及細胞外基質的合成作用，并抑制破骨細胞的生成及生物活性［4］。有研究發現，治療骨質疏松癥的有效藥物可以促進骨髓基質中的成骨細胞表達TGF-β1，并抑制 TNF-α 的表達，間接抑制骨吸收［5］。因此，TGF-β1是骨重建的關鍵性因子，在骨吸收和骨形成中起重要作用。

仙鹿壯骨方中淫羊藿、菟絲子補腎陽、強筋壯骨為君藥，輔以鹿角膠、骨碎補、杜仲溫補腎陽、滋養精血，以加強補腎養骨之力，三者共為臣藥;三七活血散瘀止痛、山楂活血且健胃導滯，促進藥物及營養物質的有效吸收，均為佐藥;全方以補腎壯骨為主，活血通脈為輔，補而不滯，疏補相合，共奏促進骨形成、抑制骨吸收之功效。根據現代藥理學研究，淫羊霍苷能顯著提高骨質疏松模型大鼠血清E2、腰椎骨密度和骨小梁的骨密度，改善骨質疏松癥的病理形態學改變［6］。

本實驗結果顯示，在改善骨質疏松癥大鼠骨密度效果方面，仙鹿壯骨方全方組 ＞君+佐＞君+臣＞臣+佐＞佐藥組，且全方組存在量效關系，療效隨劑量增大而增強。提示單純補腎藥與單純活血藥以及補腎加活血藥雖均能改善骨質疏松癥大鼠骨密度，但程度上存在明顯差異，以補腎加活血藥配伍效果最好。且后者在提高大鼠骨密度的同時，其改善骨組織形態結構效果顯著。從本實驗結果可以看出，TGF-β1在全方大劑量組中表達最多，說明全方要比各拆方部分效果顯著;各拆方組與全方大劑量組比較，只有臣佐大劑量組和佐藥大劑量組差異有統計學意義(P＜0.05)，說明組方中君藥、臣藥是主要組成部分，是該方發揮藥效的關鍵。由此可見，補腎、活血以及補腎加活血藥治療均能提升TGF-β1表達，但后者療效優于單純補腎或單純活血藥。這些都從實驗角度印證了骨質疏松癥腎虛與血瘀同時存在，治療時須二者兼顧，為總結治療該病的中藥配伍規律提供了實驗依據。

［1］ 韓麗萍，魏敏惠，等.仙鹿壯骨方對骨質疏松大鼠I型膠原基因表達的影響［J］.陜西中醫，2006，26(9):1151-1152.

［2］ 韓麗萍，魏敏惠，等.仙鹿壯骨方對骨質疏松大鼠骨密度及其形態結構的影響［J］.陜西中醫學院學報，2006，29(6):43-44.

［3］ 刁迎斌，孫玉倩，等.老年男性骨質疏松癥患者血清轉化生長因子 B1測定及其臨床意義［J］.實用老年醫學，2007，21(5):317-319.

［4］ 聶宇.轉化生長因子β與骨質疏松癥關系的研究進展［J］.安徽醫藥，2010，14(12):1489-1490.

［5］ 甘國興，莫新民.壯骨止痛方水提B部位對去勢雌鼠骨質疏松的療效及機理研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2011，17(2):158-160.

［6］ 劉仕杰，莫新民.淫羊霍苷對去卵巢骨質疏松癥雌鼠的療效及機理初步研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2012，18(3):271-273.