通腑解毒法調節大鼠腦缺血/再灌注損傷后炎癥反應及神經保護機制

李云波

缺血再灌注損傷首先由Jennings于1960年提出, 腦缺血再灌注損傷是指缺血腦組織在恢復血液灌注后, 腦組織損傷進一步加重［1］。大量研究表明, 腦缺血/再灌注損傷主要與炎癥反應、神經細胞凋亡、氧化應激、鈣離子超載等有關［2］。

大量研究表明：腦梗死急性期血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)濃度明顯增高。中醫對腦缺血的治療有不可替代的優勢, 但作用機制不十分清晰, 本實驗試圖從炎癥反應機制來詮釋通腑解毒法對急性缺血性中風可能的神經保護作用機制, 為揭示中醫藥促進腦梗死恢復作用機制提供重要依據。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物分組及模型建立 健康雄性（Sprague-Daw）大鼠 50 只 , SPF 級 , 體質量 250～300g, 由廣東省衛生廳實驗動物中心提供。合格證號：0045633 。通腑醒神膠囊(非上市藥物, 廣東省中醫院制劑, 國家食品藥品監督局批準研究用)主要成分：番瀉葉、虎杖、人工牛黃、天竺黃、栝蔞仁等藥物組成。隨機分為三組 A假手術組(10只)、B模型對照組(20只)、C通腑醒神膠囊干預組(20只)。采用大腦中動脈(MCA)阻塞方法制備大鼠腦缺血/再灌注損傷模型。通腑醒神干預組與模型對照組均按上法造模。縫合切口。立即灌胃給藥：通腑醒神干預組：配成1g/ml藥物溶液, 0.2ml/100g灌胃；假手術組同模型對照組給予相同量0.9%生理鹽水。

1. 2 指標觀察與評價 動物行為學變化和神經缺損功能測定:在造模術后不同時間點(術后2 h、術后24 h、術后 72 h、術后1 w)按下列兩種方法進行行為檢測。LongaEZ［3］的5分制評分標準。

1. 3 動物處理及取材 兩周后, 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 m l/kg)麻醉, 斷頭取腦, 置于標本瓶-20℃保存。樣品處理：取右腦組織倒入玻璃勻漿器中, 再加人冷凍的PBS, 按腦組織重量與勻漿總體積1：10的比例, 稀釋混勻。將制備好的 10%腦勻漿以 3000 r·min-1離心 15 min, 取上清置 -20℃保存待測。

1. 4 酶聯免疫吸附法測定腦勻漿上清TNF-α 酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢中美科技有限公司 0133R)實驗步驟嚴格按試劑盒說明書操作。

1. 5 腦梗死體積 72 h后假手術組隨機取3只, 治療組、模型組隨機各取7只。將腦片浸入37℃的2%四氮唑紅(TTC)染色10 min。正常組織染成深紅色, 梗死灶呈白色。根據蒼白區觀察梗死灶范圍。先用掃描儀將圖像掃入LU ZEΧ2F 型圖像分析儀分析測量腦梗死面積, 再按梯形法則計算腦梗死灶體積。

1. 7 統計學方法 計量資料結果以均數±標準差(x-±s)表示, 組間比較采用t檢驗/方差分析；方差不齊時采用秩和檢驗(Keuskal-Wallis法等)。計數資料組間比較采用χ2檢驗。（P＜0.05）表示差異有統計學意義, 采用SPSS13.0統計軟件完成。

2 結果

2. 1 各組神經功能缺損程度評分結果(表1) 腦梗死術后相同時間點比較 , 除術后 2 h 外 , 通腑組大鼠 LongaEZ 5 分制評分均低于模型組(P＜0.01)，差異有統計學意義。

表1 各組動物LongaEZ 5分制評分結果(±s)

表1 各組動物LongaEZ 5分制評分結果(±s)

注 ：△與模型組比較 , P＜0.01 ； ( )內為動物數 , 單位 :只

組別 術后2h 術后24 h 術后72 h 術后1 w TF組N.S.組1.74±0.45(19)1.85±0.45(18)2.18±0.50(19△)2.63±0.49(18)1.83±0.65(18)△2.35±0.49(16)1.31±0.47(9)△2.00±0.57(7)

2. 2 酶聯免疫吸附法測定腦勻漿上清TNF-α 各組大鼠大腦皮層TNF-α檢測結果(表2)。

表2 各組鼠腦勻漿中TNF-α水平(±s)

表2 各組鼠腦勻漿中TNF-α水平(±s)

注：TF 組：通腑干預組 , N.S.組：模型對照組 , Sham 組：假手術組。與 Sham 組比較 , *P＜0.05, **P＜0.05。

組別 C濃度(pg/ml)TF組(給通腑醒神組) 12575.64±3287.819*N.S.組(給生理鹽水) 14290.03±4689.27**Sham組(給生理鹽水) 7695.033±1481.749

各組腦組織中TNF-α濃度結果表明：大鼠腦組織損傷2w, 通腑組及模型組腦組織TNF-α表達仍高于假手術組, 具有顯著性差異(P＜0.01)；但通腑組及模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。

2. 3 腦梗死情況(表3)

表3 兩組大鼠腦梗死灶體積比較(mn3，±s)

表3 兩組大鼠腦梗死灶體積比較(mn3，±s)

注 ：*與對照組比較 P＜ 0.01。

組別 n 組別鼠數腦梗死灶體積(mm3)TF組N.S.組77 134. 40±45. 257*192. 11±19. 53

TTC染色結果表明, 假手術組腦片均紅染, 無白色梗死灶形成。再灌注72 h時, 通腑醒神干預組與模型對照組均有不同程度的白色梗死灶, 主要位于額頂部外側皮質及紋狀體。術后72 h通腑組的腦梗死體積明顯低于模型組, 兩組相比具有明顯差異(P＜0.01)。

3 討論

腦缺血后的炎癥反應一是以腦微血管內白細胞聚集穿過血管壁, 浸潤腦組織, 伴有微血管功能紊亂及局部腦組織中液體及蛋白質積聚為標志的急性炎癥過程；二是曾有研究證明腦缺血再灌注24h時血腦屏障被破壞最嚴重［4,5］因此抑制炎癥因子的表達可作為防止腦缺血性疾病的新途徑。實驗中發現, 假手術組腦切片與模型對照組腦切片對比顯示, 腦缺血再灌注損傷72 h后大鼠右腦出現大面積腦梗死現象；通腑醒神膠囊干預組腦切片與模型對照組腦切片對比顯示, 通腑解毒法可以使MCAO模型SD大鼠腦缺血/再灌注損傷 72 h 腦梗死體積顯著減小；降低造模后 24 h、72 h、1 w, 3個時間點大鼠神經功能缺損評分, 對缺血性神經細胞具有保護作用。

TNF-α是一種由細胞分泌的前炎性細胞因子, 參與機體的免疫應答和炎癥反應。TNF-a是腦缺血損傷后最早出現的炎性細胞因子之一［6］。腦缺血/再灌注損傷2w時,腦組織中TNF-α表達仍高于正常, 提示腦缺血/再灌注損傷后炎癥反應持續存在；提示中的TNF-α在腦缺血損傷作用表現為損傷和抗損傷的雙重作用, 因此, 我們推測, 通腑解毒法對缺血性中風急性期腦損傷的治療作用可能是通過抑制TNF-α等多種炎癥介質的產生、釋放,從而減輕或中斷炎癥級聯反應、減少細胞凋亡達到保護神經細胞的目的, 從而對腦損傷起到治療作用。為推廣通腑解毒法在中風急性期的應用提供了實驗依據。通腑解毒法可以明顯改善腦缺血/再灌注損傷后炎癥反應, 但有關TNF-α在腦缺血中保護與損傷作用機制有待于進一步研究與探討。

［1］ 徐海清.腦缺血病灶炎癥反應的意義.國外醫學神經病學神經外科學分冊 , 2002, 29(5):430-432.

［2］ 劉建輝, 冀鳳云, 王婷, 等.三七總皂苷對腦缺血再灌注損傷腦保護作用的實驗研究.中國臨床神經科學, 2002, 10(1):90.

［3］ 杜力軍, 周金黃, 邢東明.從中藥新藥研究對證動物模型的思考 .中國實驗動物學雜志 , 2000, 10(1):23-26.

［4］ 張勇, 楊利生, 李緩.通腑法治療出血性中風探討.陜西中醫,2005；26(2):140.

［5］ 陳苡靖.化痰通腑法治療中風病急性期探討.遼寧中醫學院學報 , 2004, 6(6)44l-442.

［6］ O'Hara0, Yonekawa Y, Tanaka k, et a1.The role of brain— derived neurotrophlc factor in transient forebrain ischemia in rat brain.Neurosurgery， 1994,34:323.